utates, but poly morphism of Rb gene (intron 20) locus is characteristic in the old people. The r elation between Rb gene (intron 20) and ageing needs further study. 【Key words】 Genes，retinoblastoma； DNA, satellite; DNA sequence, unstable
近年发现一些遗传病的致病原因是分子动态突变所致〔1,2〕,动态突变指DNA中的碱基重复序列拷贝数发生扩增而导致的突变，即含微卫星DNA的不稳定性(MSI)。重复序列拷贝数的增加或减少，均可使基因变得不稳定,可表现出病症或在染色体上出现脆性位点。Rb基因是细胞增殖的抑制基因,我们对老年人群中Rb基因（内含子20、17）多态性的分布及其与青年人群是否存在差异进行研究，以此探讨老年人群的遗传标记是否随衰老而发生改变。
材料和方法
一、材料
1.对象：老年组：100例，为1998年3月至1999年6月唐都医院心内科陕西省汉族住院患者，年龄60～75岁，男性57例，女性43例。经动脉造影和超声多普勒检查无狭窄和粥样硬化斑块，无肿瘤。青年组：56例（无血缘关系），西京医院血库提供血液标本，20～28岁，男性25例，女性31例。先后进行Rb基因内含子20和17的检测。
2.引物：(1)内含子20引物序列：A 5 -CTCCTCCCTACTTACTTGT-3 ,B 5 -AATTAACAAGGTGTGGTGG-3 (2)内含子17引物序列：A5 -TTGAACCTAACACGTTAACG-3 ,B5 -GGTAACAAGAAGTAACCTT-3 (美联公司合成)。
二、方法
1.DNA抽提：取静脉血3～5 ml，采用蛋白酶K消化法及常规酚-氯仿法提取基因组DNA。
2.聚合酶链反应(PCR)扩增：PCR反应总体积为30 μl，依次加入灭菌双蒸水，10×缓冲液3 μl，引物各25 pmol/L，dNTP 2.5 mmol/L 2.4 μl,Taq酶2.5 U(上海Promega公司产品)，DNA模板约0.5 μg。PCR扩增在美国PE公司DNA扩增仪上进行。内含子17扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性45 s；48℃退火45 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。扩增产物用限制性内切酶XbaI消化，37℃ 4 h，在1%琼脂糖凝胶（Sigma公司产品）电泳，35 V电泳1 h,溴乙锭(EB)染色，紫外光灯下观察并照相。内含子20扩增条件：97℃变性10 min，94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，循环30次，最后一次循环72℃延伸10 min。产物用8%聚丙烯酰胺凝胶（Gibco公司产品）电泳，160 V电泳4 h,EB染色，凝胶分析系统分析并照相。测序确定其重复单位。以质粒载体pBR 322 DNA/MspI为标记物。
三、统计方法
计算各组基因频率、基因型频率，并按Hardy-Weinberg平衡原理确认样本的群体代表性，组之间基因频率比较用χ2检验。基因杂合率及多态信息量（PIC）计算使用Cooper的方法。
结 果
一、老年组与青年组Rb基因17内含子的多态分布
见表1、图1。100例非肿瘤、非动脉粥样硬化老年人基因组DNA经PCR检测后，发现2种等位基因片段:945 bp(A)及630 bp+15 bp(B)，基因型频率：A/A 0.20,A/B 0.45,B/B 0.35,等位基因频率：A 0.43,B 0.57。与52例青年组比较差异无显著性（P＞0.05）。
表1 老年组与青年组Rb基因17内含子基因型分布
组别 例数 基因型频率 等位基因频率 A/A A/B B/B A B 青年组 52 0.29 0.52 0.19 0.45 0.55 老年组 100 0.20 0.45 0.3上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页
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