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腺病毒载体转染大鼠颈动脉的实验研究 |
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er direct gene transfer into anastomotic rat carotid arteries, the high level of gene expression only persisted about one month.
【Key words 】 Carrier proteins Gene transfer Braces Gene expression
(Natl Med J China, 1998, 78:534-536)
用可溶性支架，使Adv5-CMV/LacZ质粒转染大鼠颈动脉，通过β-半乳糖苷酶(LacZ基因的表达产物)活性测定和组织化学染色，观察腺病毒载体转染在体血管的有效性和外源性基因表达的时间过程。
材料和方法
一、材料
1.动物：Wistar雄性大鼠，体重300～350 g，中国医学科学院动物研究所提供。
2.Adv5-CMV及Adv5-CMV/LacZ质粒：北京医科大学心血管基础研究所提供。
3.可溶性空心小管腔吻合支架(可溶性支架)：吉林省永吉县医用塑料厂生产。
二、方法
1.Adv5-CMV/LacZ质粒的构建：将CMV/LacZ的表达片段插入P353的Swal克隆部位构建成P353-CMV/LacZ质粒，然后将此质粒和Adv5病毒基因的右臂共同转染人的293细胞即产生Adv5-CMV/LacZ质粒，该病毒载体在人293细胞内繁殖、扩增至滴度为2×1012pfu/ml。
2.可溶性支架的使用方法参见文献［1］。
3.大鼠颈总动脉的缝合：将Wistar雄性大鼠随机分为对照组48只和治疗组48只。对照组：用浸有Adv5-CMV质粒的可溶性支架；治疗组：用浸有Adv5-CMV/LacZ质粒的可溶性支架。颈总动脉吻合参见文献［1］。
4.β-半乳糖苷酶活性检测：术后2、7、14、28、60及90天，分别取对照组和治疗组大鼠各3只，剪下吻合的颈总动脉。因一条血管组织太少，故以同一组缝合术后相同天数的6条血管为1份标本。每份标本称重。用Promega公司的β-半乳糖苷酶检测系统测定LacZ基因表达产物β-半乳糖苷酶的活性。
5.β-半乳糖苷酶组织化学染色：术后2、7、14、28、60及90天，分别取对照组和治疗组大鼠各5只。剪下吻合的颈总动脉。按Willard等［2］介绍的方法，对标本进行处理和组织化学染色。
结 果
一、颈动脉吻合情况
对照组和治疗组的大鼠均成活，全部吻合的颈总动脉通畅、搏动良好。
二、β-半乳糖苷酶活性测定结果
对照组术后2、7、14、28、60及90天的颈动脉均无β-半乳糖苷酶活性，治疗组术后2天颈动脉即有β-半乳糖苷酶的表达(3.9×10-3 U/g组织)，7～14天为表达高峰期分别为10.1×10-3 U/g组织、8.9×10-3 U/g组织，28天后表达量明显减少为5.5×10-3 U/g组织，2个月时降为2×10-3 U/g组织；但可持续表达3个月之久。
三、β-半乳糖苷酶组织化学染色结果
治疗组术后2、7、14、28、60及90天每条颈动脉均可见蓝染，其中术后7及14天每条颈动脉横切面的全周均有蓝染，血管壁内层、中层的大部分细胞被染成蓝色。对照组所有颈动脉未见蓝染(图1～4)。
讨 论
近年来，有关心血管疾病的基因治疗研究取得了迅速的发展，其中在基因转移方法上积累了不少的实验经验。但脂质体转染法和逆转录病毒载体的转染效率均低，脂质体仅能转染0.1%的细胞［3］，逆转录病毒载体的转染率仅为0.1%～1%［4］。因此，研究者们一直在寻求一种更好的方法以提高在体血管基因转移、表达的效率。腺病毒载体具有高转染性、可以转染增殖和非增殖的细胞，所能携带的外源性基因大，滴度高，染色体外复制减少了随机插入性
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