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低氧对大鼠不同节段肺动脉一氧化氮合酶mRNA表达的影响 |
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significantly decreased in the 1-week or the 2-week hypoxic group compared with the control group. Conclusion These findings suggest that NOS mRNA expression by endothelial cells is greater in the larger, more proximal pulmonary arteries than at the periphery. Chronic hypoxia mainly impairs cNOS mRNA expression by proximal pulmonary artery endothelial cells and periphery pulmonary artery smooth muscle cells.
【Key words】 Anoxia Pulmonary artery Nitric oxide Gene
(Natl Med J China, 1998, 78：420-422)
至今为止，正常状态下肺动脉一氧化氮合酶（NOS）基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉NOS基因表达的影响尚不十分清楚。我们应用原位杂交技术观察了常氧及慢性低氧时大鼠肺动脉结构型NOS（cNOS） mRNA的表达与分布，以从分子水平进一步认识一氧化氮（NO）体系对肺循环的调节机理。
材料与方法
一、动物分组及低氧方法
选用雄性Wistar 大鼠21只(北京医科大学实验动物中心提供)，体重200～300 g，随机分为低氧1周组(6只)，低氧2周组（8只）及对照组(7只) 。将低氧组大鼠置于常压低氧舱（中国医学科学院基础医学研究所病理生理研究室）内, 舱内氧浓度为 10.0%±0.5%, 并以钠石灰吸收二氧化碳，控制二氧化碳浓度低于3%，每天低氧6小时，连续1周或2周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与低氧大鼠相同。
二、标本取材及原位杂交
在麻醉下，打开胸腔。取每只大鼠新鲜肺组织，迅速经10%缓冲甲醛固定。常规进行脱水及透明，石蜡包埋。连续切片，厚度5 μm。实验中所用探针为地高辛精标记的cNOS cRNA探针。cNOS cRNA 系由cNOS cDNA经体外转录而获得。cNOS cDNA长度为660 bp，由北京医科大学周波博士赠送。pGEM-3Zf(+)质粒载体长度为3 199 bp。原位杂交前标本经二甲苯脱蜡及蛋白酶K处理，以4%多聚甲醛于室温下进行后固定(10分钟)。每片滴加杂交液25 μl［标记探针 40 μg，去离子甲酰胺10 μl，鲑精DNA 1 μl，Denhardt′s液 2 μl，1 mol/L二硫苏糖醇(DTT) 1 μl，20×标准柠檬酸盐-氯化钠液 (SSC) 4 μl及50% 硫酸葡聚糖钠 2 μl］，用石蜡封口膜覆盖，42℃，保温24小时。系列SSC洗涤，以1∶100马血清蛋白封闭。将切片置于1∶500抗地高辛单克隆抗体(德国Boehringer Mannheim产品)中，室温1小时。采用碱性磷酸酶-5-溴-4-氯-3-吲哚/硝基四氮唑蓝方法检测杂交体。在光学显微镜下，紫蓝色产物为核酸杂交阳性信号。
三、结果判断标准
根据肺动脉在肺内的位置，对以下3型肺动脉进行研究：与呼吸细支气管伴行的肺动脉、与终末细支气管伴行的肺动脉及与细支气管伴行的肺动脉［1］。任一肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞内无杂交阳性信号者为阴性(-)；1%～50% 呈现阳性信号者为弱阳性(+)；51%～100% 呈现阳性信号者为阳性(++)。根据以上结果，以每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞表达NOS mRNA不同等级的百分数乘以该等级的加权值（－：0；＋：0.5；＋＋：1.0），从而得出每只动物肺动脉内皮细胞或平滑肌细胞cNOSmRNA表达的阳性积分值（总分为100分〕［1］。对每只大鼠的肺组织原位杂交切片至少观察15～20条肺动脉。阴性对照片杂交时不加cNOS cRNA探针，其他操作程序完全相同。
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