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蛋白激酶C在非心脏器官预处理中的作用 |
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P正磷酸钠为中国原子能研究所产品(放射比强度为26×37mBq/ml)，余为市售分析纯产品。
二、方法
1.PKC对大鼠原位灌流小肠缺血PC的影响：体重200～250 g健康雄性Wistar大鼠，参照文献［2］的方法复制肠系膜上动脉(SMA)原位灌流I/R模型。预灌注10分钟后随机分为6组(每组6只鼠)：(1) 缺血再灌注(I/R)组：停灌SMA 1小时、复灌15分钟结束实验。(2) 预处理(PC)组：预先停、复灌SMA各5分钟，反复3轮后按(1)组程序操作。(3) H7+PC组、(4) PB+PC组操作同(2)组，但于PC的第3轮再灌注液中分别加入PKC抑制剂H7(40 μmol/L)或PB(0.48mg/L)。(5) PB+I/R组：操作同(1)组，但预灌注最后5分钟灌注液中含有PB(0.48 mg/L)。(6) 对照组：持续K-H液灌注75分钟。收集再灌注期间流出液测定乳酸脱氢酶(LDH)和组织蛋白酶(CD)活性［3］；硫代巴比妥酸法测定肠组织脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。
2.PKC对大鼠肢体缺血PC的影响：按文献［4］方法复制大鼠肢体原位灌流模型，预灌注10分钟后随机分为5组：(1) I/R组：停灌股动脉4小时、复灌2小时结束实验。(2) PC组：预先停/复灌股动脉各5分钟，反复3轮，然后按(1)组程序操作。(3)、(4)组分别为H7+PC组和PB+PC组：操作同(2)组，但在PC的末次灌流液中分别加入H7 (40 μmol/L)和PB(0.48 mg/L)。(5) 对照组：持续灌注K-H液6小时。分别收集再灌注期间流出液测定LDH、CD活性，结束实验时取腓肠肌组织备测MDA和组织湿干重比值。
3.PKC对培养的大鼠胸主动脉VSMC缺氧PC的影响：以贴块法［5］进行VSMC培养，用第4～6代细胞常规处理后进行实验：(1) 缺氧PC对VSMC缺氧复氧损伤的影响：实验分为6组：① 缺氧复氧(H/R)组：将细胞缺氧孵育2小时，复氧孵育1小时［6］。② 缺氧PC组：细胞进行20分钟预缺氧后再按①组程序进行H/R操作。③、④组分别为H7+PC组和PB+PC组：预先分别以H7或PB预孵育VSMC 10分钟，再按②组程序依次进行PC和H/R操作。⑤ PMA+H/R组：细胞以PKC激动剂PMA(100 nmol/L)预孵育10分钟后再进行H/R操作。⑥对照组：细胞持续置培养箱孵育。结束实验时测定培养液中LDH活性，以台盼蓝排斥法计算细胞存活率［6］。(2) 模拟缺氧PC的短暂缺氧对VSMC 32 P掺入和PKC活性的影响：实验分为3组(每组6只鼠)：① 短暂缺氧(transient hypoxia, TH)组：细胞缺氧孵育20分钟。② H7+TH组：以H7 (40 μmol/L)预孵育10分钟后按①组程序操作。③对照组：细胞持续孵育20分钟。经上述处理后细胞以32P正磷酸钠(3.7×103kBq/孔)标记后，测定32P参入量及细胞总PKC活性［7］。(3) 短暂缺氧对VSMC蛋白磷酸化的影响：按上述方法将细胞分为TH、H7+TH和对照组，分别操作后加入32P正磷酸钠(3.7×103kBq/孔)标记细胞，经洗涤、溶解后作十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS－PAGE)电泳［8］，胶板经固定、染色、脱色后切割成0.5 cm宽，在β液闪仪上测定各条带蛋白参入的32P放射活性。(4) 去磷酸化反应对VSMC缺氧PC的影响：实验分7组：①、②、③组分别为H/R、PC和对照组(操作同(1))，④、⑤组分别为OA＋PC组和BDM＋PC组，于预处理前分别向实验各孔加入蛋白磷酸酶抑制剂okadaic acid (OA，2 μmol/L)或2，3-二乙酰一肟(BDM，20 mmol/L)预孵育10分钟后依次进行PC和H/R；⑥、⑦组分别为OA＋H/R和BDM＋H/R组，于H/R前分别向实验各孔中加入OA (2 μmol/L)或BDM(20 mmol/L)预孵育10分钟后进行H/R。结束实验时，取培养液测定LDH活性，计算细胞存活率，以高效液相法测定细胞内ATP含量。
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