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纤维粘连蛋白对膀胱癌细胞生物学行为的影响 |
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材料与方法
一、材料
含有人FN cDNA片段的质粒 pFH 100由法国CNRS URA病理生理实验室Sylvie Dufour教授惠赠；逆转录病毒载体pLJ由美国麻省理工学院生物系Mynes KO教授赠送；低分化膀胱移行细胞癌253J细胞由美国依阿华大学医学部泌尿外科See WA教授赠送。限制性内切酶、修 饰酶、随机引物以及DNA标记试剂盒为美国Promega公司产品；Lipofectin、鼠抗人FN抗体及人工基底膜凝胶为美国GIBCO公司产品；免疫组织化学试剂盒及MTT购自中山公司。
二、方法
1.FN逆转录病毒载体的构建及导入253J细胞：扩增pFH 100和pLJ质粒，提取DNA，用SphⅠ和ClaI切下pFH 100中FN片段，补平，用BamHI切开PLJ，将FN cDNA片段和线性化载体进行连接反应，转化感受态细胞，经酶切分析选出正向连接的重组质粒，用Lipofectin将重组质粒和空载体转入PA317细胞中，克隆扩增后制备病毒液，用高滴度病毒液（3.2×104 CFU/ml）感染253J细胞，筛选3周产生抗性克隆（253FN和253pLJ），转移后传代培养。
2.S-P法免疫组织化学：细胞生长80%融合，丙酮固定5分钟，实验步骤按试剂盒说明书进行，一抗为1∶50鼠抗人FN单抗，DAB显色后常规复染，脱水，透明，封片。设磷酸盐缓冲液(PBS)，空白对照。
3.细胞生长能力观察：将253FN，253J和253pLJ细胞以1×104/ml分别接种于25 ml培养瓶中，共7组，每组3瓶，CO2温箱培养，每天计数一组细胞，做出生长曲线。
4.细胞-基质粘附试验：4℃用PBS将人工基质胶稀释成5mg/ml，加入96孔板中，20 μl/孔，37℃1小时，铺好基质胶的96孔板中加入细胞5×105/ml，100 μl/孔，37℃培养20、40、60、80及100分钟，吸出培养液，加入10 mg/ml的氮兰四唑盐(MTT)，20 μl/孔，继续培养4小时，吸出MTT，加入二甲基亚砜100 μl/孔，室温15分钟，用酶联免疫检测仪在570nm测光密度(A)值。
5.同质性粘附试验：借鉴高进［4］的方法，将253J和253FN细胞分别接种于96孔板中，使其长满单层不留空隙，以5×105/孔分别接种同种细胞，37℃摇床40 r/min，于20、40、60、80及100分钟吸 出含有未粘附细胞的培养液。得出粘附的细胞数。
6.细胞分离试验：根据文献［4］，将253J和253FN细胞以5×105/孔分别接种于6孔板中，培养至细胞完全汇合，加入0.02%乙二胺四乙酸1 ml，室温置水平摇床40 r/min，于2、4、6、8及10分钟收集脱落细胞计数，未脱落的细胞用0.25% 胰酶消化计数。细胞脱落率公式为：
细胞脱落率＝脱落细胞数/细胞总数×100%
7.侵袭试验：参照Albin等［5］方法，用1 mg/ml基质胶铺盖于8 μm孔径的微孔滤膜上，Boyden小室的下室加入200 μl驱化剂（无血清培养24小时的NIH3T3细胞条件培养基），将2×105/ml的253FN、253J和253pLJ细胞悬液以0.8 ml/室加到上室中，培养12小时，取出滤膜，甲醛固定5分钟，HE染色，250倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，计算平均值，每组计数3份样本。
8.统计学方法：采用t检验。
结果
一、FN基因导入253J细胞前后免疫组织化学染色
用免疫组织化学S-P法染色对细胞的FN蛋白表达进行定位分析，253FN细胞的胞浆胞膜呈棕红着色，免疫阳性沉积物明显增多，而253J细胞仅有轻微着色，证明转染后FN蛋白表达增加（图1，2）。
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