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胚胎运动神经元种植至失神经骨骼肌内的观察 |
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核能用相应抗体检测出来［1，2］。
二、胚胎运动神经元的分离与制备
前述标记母鼠在孕12天时，用4％水合氯醛腹腔内注射麻醉，无菌操作下剖开子宫，取出胎鼠，浸入0.6%葡萄糖缓冲液中，在解剖显微镜下见胎心跳动，证实为活胎。取出脊髓腹侧半，剪碎后，在37℃下，用无钙、镁离子的D-Hank液配制的0.25%的胰蛋白酶消化30分钟；800r/min离心5分钟，吸出上清，沉淀复加Hank液，漂洗后，离心去上清；沉淀加培养液，制成细胞悬液，入培养箱备用，本实验中放置24～48小时。本培养液是在Eagle液内加10％胎牛血清、0.6%葡萄糖及5 ng/ml的神经生长因子［1，2］。
三、胚胎运动神经元的种植
取180～200 g的SD大鼠24只，同前麻醉后，在右侧坐骨神经及胫神经起始处分别结扎，在两结扎线间切断坐骨神经，近断端埋植于臀部肌肉，制成腓
图1 Nissl染色示神经细胞位于肌细胞横断面(箭头)间 ×400 图2 示神经细胞发出AchE阳性长轴突，并见发芽 ×200 图3 示肌细胞间AchE染色强阳性细胞，并见轴突与运动终板(箭头)相连 ×200 图4 示Brdur免疫染色阳性神经细胞核 ×1 000 图5 ATP酶染色(pH 9.5)示实验组肌细胞的群化(箭头) ×100 图6 ATP酶染色(pH 9.5)示对照组肌细胞横断面 ×100
肠肌失神经模型。取前述胚胎运动神经元悬液，细胞计数为5.4×106个/ml，用100 μm、0.1 ml的微量进液器，抽取0.2 ml，于12只大鼠腓肠肌的每一头各注入0.1 ml，见肌膜涨起，无液体外漏。另12只大鼠腓肠肌内注入等量的离心上清液与培养液的混合液，作为对照组。
四、实验观察
于实验后9、22周，各取6只实验侧肌肉，放入已在液氮中预冷的异戊醇内10秒钟，然后作20 μm厚的冰冻切片。分别行1％中性红Nissl染色、乙酰胆碱酯酶(AchE)染色、ATP酶染色及Brdur免疫组织化学染色［1～3］。免疫染色用ABC法，同时设置阴性对照。试剂由Sigma公司提供。用TJTY-300分析系统测量神经元的平均直径和面积。
结果
一、神经细胞Nissl染色观察
在每一例实验侧骨骼肌的切片中，均见胞浆Nissl颗粒阳性，胞核大而圆，核内含深染的核仁，呈多极性的典型神经细胞；可见长的突起及多突起；细胞形状各异，多位于肌细胞间的结缔组织中，弥漫分布；神经细胞大小不一（图1)。
二、神经细胞AchE染色观察
每一例实验侧骨骼肌切片行AchE染色，均可见神经细胞胞浆内胆碱酯酶颗粒呈茶褐色强阳性，胞核着色浅淡，核仁深染，位于肌细胞间；并可见细胞长出很长的轴突，沿肌细胞的长轴延伸，轴突也呈AchE染色强阳性，并发芽；有些神经细胞多个突起均着色；胞体着色深浅不一(图2、3)。
三、免疫组织化学染色
在每一例切片中，均见染色强度不一Brdur标记的细胞核，弥漫于肌细胞间；细胞核的大小不一，可能大核属于运动神经细胞，小核属于胶质细胞(图4)。阴性对照片无阳性反应。
四、失神经骨骼肌的再支配
由ATP酶染色见实验组肌细胞有纤维型分化，横断面积大小不一，大细胞成群化存在，小细胞则无群化现象，群化提示肌纤维的再支配(图5)；而对照组骨骼肌纤维横断面积明显较小，排列紊乱，胶原增生明显，无肌纤维的群化现象(图6)。
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