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粘附分子P选择素单克隆抗体抑制胃癌转移的实验研究 |
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与肿瘤细胞的粘附作用，在肿瘤转移中可能起重要作用［1］。我们以往的研究发现，P选择素在胃癌中表达与肿瘤转移及预后显著相关［2］。本研究在胃癌转移动物模型上，进行P选择素单克隆抗体(简称单抗)抑制胃癌转移的实验研究，并对其中的作用机制进行了探讨，现报道如下。
材料与方法
一、材料
1.主要试剂：异硫氰酸胍、氯仿、水饱和酚、异丙醇购于华美公司，RNA酶抑制剂(RNasin)、逆转录酶(AMV-RT)、Tag DNA聚合酶系美国Promega公司产品。P选择素单克隆抗体（鼠源性，SZ-51）购于苏州医学院。
2.实验动物：重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠，健康，雄性，6～7周龄，体重为20～25 g，由上海市肿瘤研究所实验动物部提供。
二、方法
1.动物实验方法：SCID小鼠30只，随机分为试验组(20只)和正常对照组(10只)。试验组动物模型制作采用人胃癌组织胃壁原位移植方法［3］。肿瘤组织系上海市肿瘤研究所裸鼠皮下传代的人胃癌组织(SGC-7901)。模型制作后，动物随机分为P选择素单抗注射组（单抗组，9只鼠）和PBS注射组（PBS组，11只鼠）。术后第3天，单抗组静脉内注射P选择素单克隆抗体，每次100 μg（以100 μl PBS液稀释），每周2次，共3周；PBS组注射PBS缓冲液每次100μl，每周2次，共3周。
2.标本采集及病理学检查：所有动物于术后第6周末处死，取胃壁生长的肿瘤组织、肿大淋巴结及可疑转移脏器，10％甲醛固定和石蜡包埋，常规切片，HE染色，观察肿瘤生长和转移情况。同时取部分胃癌组织置液氮下保存。
3.RNA抽取及定量［4］：胃癌组织总RNA的提取按硫氰酸胍-酚-氯仿一步法进行。用紫外分光光度计测定总RNA的纯度及含量，用甲醛凝胶变性电泳鉴定RNA的质量。
4.鼠的P选择素引物序列［5］：由中国科学院上海植物生理研究所合成，Sense 5′-ACG AGC TGG ACG GAC CCG-3′，antisense 5′-GGC TGG CAC TCA AAT TTA CAG C-3′，扩增片断为181个bp。以β2 MG为内参基因，扩增片断为120个bp。
5.cDNA 合成：将5μg总RNA加入经二乙基焦磷酰胺(DEPC)处理过的eppendorf管，各成份用量参照Promega公司提供的逆转录试剂盒(Promega reverse transcription system)说明作适当调整，用合成的P选择素3′端引物（反义链）代替寡聚核苷酸12～18；在25 μl总反应体积中含2.5 μl 10×缓冲液，5 μl 25mmol/L MgCL2，0.6 μl RNA酶抑制剂(RNasin，40 U/μl)，2.5 μl脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP混合，4种dNTP水溶液浓度为10 mmol/L，pH7.0)，0.6 μl鼠白血病病毒反转录酶(AMV reverse transcriptase)。P选择素及β2 M的 3′端引物(反义链)各1.5 μl(20 pmol/μl)，用去离子水补至终体积25 μl，石蜡油封顶，42℃反应1小时后，94℃灭活10分钟，冷却至0℃，置－20℃下保存待测。
6．PCR反应及分析：50μl 反应体系中含10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCL2 3 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，P选择素、β2 MG的有义链、无义链引物各1 μl(20 pmol/μl)；94℃变性5分钟加Taq 酶2 μl。94℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸90秒，扩增35个循环后，72℃延伸10分钟。PCR结束后，取10 μl样品在8％聚丙酰胺凝胶上电泳，0.2％硝酸银染色。
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