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用核酸荧光定量PCR技术检测尖锐湿疣HPV的研究 |
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高素平 贾印峰 刘毅
摘要：对50例病理诊断为尖锐湿疣（CA）的标本进行了核酸荧光定量PCR检测，检出率为96％。结果表明：核酸荧光定量PCR可一次性完成对尖锐湿疣HPV感染的检测，检测覆盖面宽，漏检率低，对尖锐湿疣的诊断有较好的应用价值。
关键词：尖锐湿疣 乳头瘤病毒 荧光定量聚合酶链反应
中图分类号：R446.33 文献标识码：A
Abstract：Fluorogenic quantitative PCR had been done in 50 cases of condyloma acuminatum diagnosed by histopathology.The results showed that the methodcoulddetect the infection of HPV of condyloma acuminatum，withawidecoverageand alow missed-detection rate.Moreover，it is of good practical value in the diagnosis of condyloma acuminatum.
Key words：Condylomaacuminatum Papillomavirus FQ-PCR
尖锐湿疣（CA）系感染人类乳头瘤病毒（HPV）所引起的生殖器、会阴和肛门部位的表皮瘤样增生，是一种常见的性传播疾病。诊断该病的实验室方法很多，其中核酸荧光定量PCR技术融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点，具有很高的检出敏感性和特异性。近日，我们对50例病理诊断为CA的活检标本，同时进行了核酸荧光定量PCR技术检测，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 50例尖锐湿疣患者均经病理证实。男31例，女19例；年龄23～52岁，平均33.1岁；病程半月～1年，平均3.5个月。已婚39例，未婚11例。其中有性乱史者37例，无自觉症状者38例，其余患者有不同程度的瘙痒。损害部位：男性见于冠状沟、包皮内板、龟头、系带及肛门周围，女性见于大小阴唇、阴道口、阴道内及会阴处。31例患者仅1处损害，余19例皮损累及2处或2处以上。皮损以乳头瘤状、菜花状、丝状、指状为主。所有皮损的醋酸白实验均为阳性。
1.2 方法 ①标本制备：尽量选取与典型CA损害相符合的病变组织。所检标本尽量在一块组织中分取。组织活检采用剪除法，1份用于核酸荧光定量PCR检测，1份置10％的中性福尔马林中固定，常规制片、连续切片，做HE染色，行皮肤病理检查。核酸荧光定量PCR检测标本系用新鲜组织，低温保存，在12小时内完成检测。标本在无菌条件下切碎置于试管中，加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取液体转至1.5ml离心管中，按12000r／min离心5分钟。取沉淀，加无菌生理盐水1ml打匀，按12000r／min离心5分钟，再洗涤1次。取沉淀直接加50μlDNA提取液充分混匀，沸水浴10分钟，离心5分钟，取上清液2μl做PCR反应。②PCR反应前荧光检测：取一HPVPCR反应管（中山医科大学达安基因诊断中心提供），直接加入处理后样品或质控标准品2μl（阴性对照直接取一反应管），用振荡器振荡2～3秒钟混匀，按6000r／min离心数秒。将所有反应管置PCR仪33℃保温，1分钟后迅速逐个将反应管放入DA620微量荧光检测仪中，检测并记录读数A0。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。③PCR扩增：将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃120秒，共做40个循环后置33℃保温。④PCR反应后荧光检测：待各反应管充分冷却至33℃后，迅速将扩增后的反应管放入DA620微量荧光检测仪，检测并记录读数A1。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。
2 结果
50例尖锐湿疣标本均符合病理诊断标准［1］：①棘层空泡细胞呈密集的乳头状增生；②表皮角化不全；③棘层见空泡细胞，空泡细胞体积大，胞腔空虚，细胞核轻度异型核膜皱折，偶见双核或多核。
50例经核酸荧光定量PCR检测，有48例阳性，其中37例有性乱史者均为阳性。48例阳性患者的临床症状均典型。2例呈阴性，其中1例损害位于阴道内，呈乳头状；1例损害位于小阴唇，呈丝状。
3 讨论
尖锐湿疣实验室检测方法很多，常规PCR技术简便、快速、灵敏，但存在着不能定量、污染、易造成假阳性等缺陷。[1] [2] 下一页
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