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ELISA法测定血清 型胶原 |
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4.HRP标记单抗：改良过碘酸钠法
取5mgHRP溶于0.2mol/L pH5.6的乙酸缓冲液0.5ml，再加入0.1mol/L 0.25ml的过碘酸钠混匀。加入单抗约5mg混匀，调pH为9.0，4℃过夜，加入硼氢化钠0.5mg混匀，透析过夜。
5.双抗夹心法的建立(EIA)
多抗用缓冲液稀释成10μg/ml，包被NUNC板，4℃过夜。洗后加入2%BSA封闭。加入系列稀释的标准CⅣ和待测血清，每孔100μl，37℃水浴1小时，洗后加入HRP-单抗(1∶500)100μl,37℃水浴1小时后，洗5次，加入OPD底物液，显色30分钟，终止后酶标仪490nm比色。计算标本CⅣ含量。
结 果
一、Ⅳ型胶原纯度
经SDS电泳，以Sigma 6H分子量标准，分为5条区带，与文献报道相符。
二、单抗特异性
抗CⅣ的杂交瘤细胞分泌的单抗与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应，有较好的特异性。
三、单抗和多抗纯度
从SDS-PAGE结果可以看出，正辛酸纯化后的单抗和DEAE纯化后的多抗在25KD和56KD有两条带，代表免疫球蛋白的轻链和重链，说明纯度良好。
四、单抗亚型鉴定
ELISA法加入相应抗血清，单抗为IgG1型，轻链为λ型。
五、酶标单抗的鉴定
标记率即A403nm/A280nm值，表示酶标抗体中HRP所占的比例，结果为0.4。
六、ELISA方法的评价
1.标准曲线的建立
CⅣ抗原倍比稀释，得出测定范围从31～1000μg/L呈线性关系。
2.灵敏度、重复性和准确性
本法的灵敏度为22.0μg/L。高低浓度的血清标本重复10次测定，批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%。用回收实验来测其准确性，平均回收率为96%。
3.与日本试剂盒比较
本法与日本第一化学药品株式会社生产的Ⅳ-C试剂盒同时测定50份血清标本，相关性良好，r=0.93,相关方程Y=0.8121X+25.4947。
七、临床初步应用见附表。
附表 血清CⅣ含量测定结果
组别 例数 CⅣ(μg/L) s
对照组
肝硬化组 56
35 78.5
314.5* 26.2
186.6
与正常对照组比较*P＜0.01
讨 论
本研究选用正辛酸-硫酸铵沉淀法来纯化腹水，简便易行，纯度高［3］。首先，白蛋白和其它非IgG蛋白质被正辛酸沉淀，IgG由硫酸铵沉淀。多抗采用快速纯化法［4］，即用DEAE-纤维素吸附lgG以外的蛋白而达到纯化IgG的目的。本法简便、快速，纯化的抗体经SDS-PAGE鉴定纯度良好。
本研究采用改良的过碘酸钠法标记单克隆抗体。理想的酶结合物标记率A403nm/A280nm之比在0.3～0.6之间较好。我们使用进口酶标记单抗，标记率为0.4，达到要求。
针对Ⅳ型胶原的放免测定法(EIA)采用的抗体为多抗，反应时间长，而且有一定放射污染。竞争性EIA法［5］灵敏度低，且不能保证抗原抗体沉淀完全。
本研究采用多抗包板，单抗标酶棋盘滴定法确立最适浓度，建立双抗夹心EIA法。CⅣ单抗的特异性保证了此方法的特异性，与Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原无交叉反应。采用高纯度的抗体提高了反应的敏感度，拓宽线性。批内与批间变异系数分别为5.2%和11.8%，说明精密度较好。平均回收率为96%，说明此方法的准确性良好。本法与进口的CⅣ酶免测定试剂盒进行比较，两者的相关性很好。临床测定结果表明，肝硬化患者血清CⅣ水平显著性高于正常对照组。本法成本较低，操作简便，而进口试剂盒采用试管法，操作复杂，价格昂贵，所以本法在国内有良好的发展前景。
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