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ELISA法测定血清 型胶原 |
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刘向祎 寇丽筠
摘要 目的 建立一种测定血清Ⅳ型胶原(CⅣ)的夹心ELISA法。方法 分别制备Ⅳ型胶原的多抗和单抗，正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化，用改良过碘酸钠法标记单抗。采用多抗包板，单抗标酶，建立测定血清CⅣ的双抗夹心ELISA法。结果 该法灵敏度为22.0μg/L,线性范围为31～1000μg/L。本法的批内和批间变异系数分别为5.2%和11.8%，平均回收率为96%。与进口试剂盒相比相关性良好。临床应用结果可信。结论 本法灵敏、准确、简便，便于临床推广使用。
关键词 Ⅳ型胶原 双抗夹心酶联免疫吸附法
Detection of type Ⅳ collagen by enzyme immunoassay
Liu Xiangyi，Kou Liyun
(Beijing Tong Ren Hospital, Beijing100730)
Abstract Objective To develope a sandwich enzyme-immunoassay (EIA) for human serum type Ⅳ collagen(CⅣ).Methods We produced the polyclonal antiserum and monoclonal antibody. It was purified by a simple, non-chromatographic procedure. The polyclonal antibody was used as a solid phase and a horseradish peroxidase-labeled monoclonal antibody was used as a conjugate.Results The sensitivity of the method was 22. 0 μg/L.The working range of standard curve was 31～1000μg/L.CVs of intraassay and inter-assay were 5.2% and 11.8% respectively. The average recovery was 96%. A significent correlation was found between our method and a commercial kit maded in Japan. Conclusions The ElA of CⅣ is sensitive, accurate, specific and simple.
Key Words Type Ⅳ collage Sandwish immunoassay
Ⅳ型胶原(CⅣ)是基底膜的主要成分，它的主要存在形式是含α1(Ⅳ)和α2(Ⅳ)链的异三聚体，分子排列成网状。近来研究表明［1］，血清CⅣ水平与肝纤维化密切相关，被认为是肝纤维化早期诊断较好的指标。测定CⅣ血清含量报道多为放免法，有一定放射污染。Obata等［2］应用单抗建立了酶免法，国内尚未有测定血清CⅣ酶免法的报道。本文用多抗包板，单抗标酶，建立了一种双抗夹心法来测定血清CⅣ水平。
材料与方法
一、材料
Ⅳ型胶原(Sigma公司提供),NUNC板(丹麦)，DEAE-纤维素(Whatman公司提供)，过碘酸钠，辣根过氧化物酶(HRP，Sigma公司提供)Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原(本室自提)，其余为国产分析纯试剂。家兔和BALB/C小鼠由北京医科大学动物室提供。
二、临床标本
正常对照组(56例)，来自体检正常者；肝硬化患者(35例)来自住院确诊病人。
三、方法
1.单抗大量生产和纯化
杂交瘤细胞腹腔注射小鼠产生腹水。腹水用正辛酸-硫酸铵法纯化。间接ELISA法进行单抗特异性鉴定。
2.多抗的产生和纯化
免疫家兔制备抗血清。采用IgG的快速纯化法：于湿基DEAE-32纤维素加入稀释的兔血清，4℃吸附杂蛋白，充分搅拌抽干，滤液为纯化的IgG。
3.抗体纯度鉴定(SDS-PAGE)
制备12%分离胶，10%浓缩胶，样品加入等量缓冲液，沸水浴2分钟，冷却后加样，电泳(25mA)4小时，经考马斯亮蓝R-250染色。
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