在体微透析检测豚鼠胆红素脑病模型脑组织兴奋性氨基酸神经递质

1　材料与方法

1.1　动物模型制作
　　生后1～2 d豚鼠18只，重20～25 g，雌雄不拘，购自上海生物制品研究所。随机分成对照组和模型组，每组9只。对照组豚鼠予生理盐水0.5 ml腹腔注射，模型组豚鼠［2，3］于腹腔内给予胆红素200 μg/g。
1.2　脑组织形态结构观察
　　动物模型制作后8 h，取豚鼠脑组织投于戊二醛溶液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，电镜观察。
1.3　微透析提取神经递质
　　微透析探头(microdialysis probe)购自瑞典CMA公司，透析膜长3 mm、直径0.5 mm、透析截流分子量20 000 Daltons，探头长14 mm，不锈钢外管直径0.64 mm。模型制作8 h后用乙醚吸入麻醉，按Sander方法［4］将大鼠固定于立体定向仪(stereotaxic frame)中，参照鼠立体定向图谱，将探针固定于海马区域(探针位置术后经由解剖证实)。灌流液为Kreb s-ringer液，流速2.5 μl/min，灌流1.5 h后开始收集检测样本，持续收样1 h。
1.4　EAA神经递质HPLC分析
　　取微透析细胞外液50 μl、加内标液(甲硫氨基砜250 μM/L)50 μl，涡流振摇，加入micropure separator (millipore)离心去除蛋白质、核酸及悬浮大颗粒。取滤液50 μl，加入衍生化试剂(PITC异硫氰酸苯脂∶甲醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)50 μl涡流振摇、室温反应10 min，真空干燥［4］。真空干燥样本加入NaH2PO4稀释液500 μl, 涡流混匀，取200 μl混合液进样。分析柱为HPLC-氨基酸专用分析柱，管径15 cm×4.6 mm(ID)，柱温维持38℃；柱填充Taq硅胶，规格120A；流动相A泵进样15MNaAc，B泵进样乙晴∶甲醇∶水=9∶3∶8，A+B进样流速1 ml/min。紫外检测、波长254 mm、氨基酸波峰积分微处理计算氨基酸含量［4］。

2　结果

2.1　脑组织形态结构
　　电镜观察显示:豚鼠腹腔给予胆红素后8 h，脑神经元及其线粒体肿胀，而正常对照组脑线粒体不肿胀。见图1，图2。

图1　模型组线粒体肿胀明显(×6000倍)
Fig 1. Mitochodrial swelling in brilirubin precipitated neurons.

图2　对照组正常线粒体(×6000倍)
Fig 2. Normal neuron mitochondria in the control group (×6000)

图3　透析液HPLC氨基酸色谱图
Fig 3. Excitatory amino acid chromatography

2.2　透析液HPLC氨基酸含量及色谱图
　　模型组透析液Gly含量为21.35±4.87μM，明显高于对照组14.02±1.56 μM(P<0.01)；模型组透析液Asp，Glu含量与对照组比较差异不显著(P>0.05)。见附表。色谱图见图3。

附表　透析液氨基酸含量(±s，μM)
Table　Contents of EAA in the extracelluler liquid of brain
 

组别　 n Asp Glu Gly
对照组 9 0.37±0.294 2.56±0.40 14.02±1.56
模型组 9 0.674±0.453 5.76±5.35 21.35±4.87
t 　 1.427 1.415 3.132

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