生鼠缺氧模型，取左半内侧0.5 cm厚脑组织制作匀浆进行测定。根据临床表现与脑组织光镜和电镜检查鉴定模型。
1.1.2 仪器 DNA扩增仪、荧光辉度扫描仪。
1.1.3 试剂 变性溶液、Taq酶及其缓冲液系统, AMV逆转录酶系统。引物序列如下：
cNOS：
5 CCGGATCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCATG 3
5 CCGGAATTCGAATACCAGCCTGATCCATGGAA 3
该引物扩增的cDNA产物长度为614bp。
对照物β-actin
5 GGATCCAGCCTCAAAGAGCTTAC 3
5 GAATTCCAAGAGCCTTGAGCAATGGA 3
该引物扩增产物长度为280bp。
1.2 实验方法
按Chomczynski［5］介绍的一步法抽提RNA,测定浓度及纯度后逆转录生成cDNA，经DNA扩增反应，产物上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳，Polaroid成像，照片光密度扫描，半定量计算cNOS的含量。
1.3 统计学分析
采用方差分析。先进行方差的齐性检验，然后在各组份间用q检验进行多重比较。
2 结果
2.1 模型检验
光镜1 h组变化轻微，脑组织有轻度水肿，细胞体积轻度增大，毛细血管周围间隙扩张不明显。4 h组脑细胞明显水肿，组织疏松，毛细血管周围空隙明显。电镜可见线粒体结构破坏。见图1。
图1 缺氧1 h、4 h病理照片
Fig 1. Pathological photo of 1 h, 4 h hypoxia
2.2 cNOS mRNA的表达
大鼠1 h和4 h组的cNOS mRNA 表达均较对照组显著上升(P<0.01)，4 h组较1 h组明显下降(P<0.01)。见表1，图2。
图2 cNOS扩增电泳图
Fig 2. Electrophoresis of cNOS PCR product
表1 cNOS mRNA表达半定量值
Table 1. Relative value of cNOS mRNA expression in each group
组别 n 半定量值
对照组 11 0.74±0.03
1 h组 7 0.91±0.02*
4 h组 7 0.87±0.02*
*与对照组相比，P<0.01
3 讨论
NO是一种重要的信使分子，它在血管、免疫尤其神经系统有广泛的生物学作用。生理条件下，NO是不典型递质或细胞信使，在脑缺血或脑缺血再灌注损伤中具有神经保护和神经毒性两种倾向,过量生成或在病理性刺激时能产生神经毒性［1，6,7］。NOS以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在NADPH，FMN，FAD及BH4等因子辅助下催化合成NO和L-瓜氨酸。NO性质活泼半衰期极短。对NOS及其基因表达变化的研究是对NO进行深入探讨的重要环节。
cNOS以非活性形式存在于某些细胞中，可被相应的激动剂迅速激活，激活后酶活力持续时间很短。cNOS的活力完全依赖钙及钙调蛋白的作用，引起NO短暂释放。cNOS每次激活合成少量NO，钙离子浓度下降，cNOS失活；钙浓度再次升高，cNOS也可被再度激活，生物效应以细胞间信息传递为主［1］。
NO对脑缺氧的影响是脑损伤研究的一个重点，本实验组织学变化显示缺氧1 h的病理改变轻微而4 h的病理改变极为显著。相应的缺氧后脑组织中cNOS mRNA在1 h，4 h时表达均较对照组增加(P<0.01)，但4 h组较1 h组明显下降(P<0.01)。可见缺氧早期脑组织中cNOS mRNA表达迅速上升对缺氧脑组织可能起保护作用。这也与以往报道相似［7］。
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