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细胞凋亡检测的研究进展及其与疾病的关系 |
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此蛋白标记上生物素，可通过免疫组化的方法对组织切片或细胞涂片进行凋亡细胞的检测［7、8］。该法还可进行双重(或多重)标记，将Annexin Ⅴ与抗细胞膜表型抗体同时应用，可在测定凋亡细胞同时测定细胞表型特异性。如用两种发不同颜色的荧光素，PI(橙色)和FITC(绿色)，分别标记抗CD 4单克隆抗体和Annexin Ⅴ，与PI一起通过流式细胞仪，可同时观测研究细胞表型与细胞凋亡的关系。
2.3 反映DNA有规律断裂的方法 Ap过程中,DNA有规律地断裂可以通过下述几种方法检测出来。
2.3.1 琼脂糖凝胶电泳法 细胞悬液经裂解消化按常规法提取DNA后，于含EB的琼脂糖凝胶中进行电泳，正常细胞DNA呈单一条带；细胞Ap时呈典型的梯状条带，系180～200 bp左右的及多聚核小体的梯状DNA条带；坏死时则呈模糊的弥散状条带。DNA电泳法是判断Ap的经典方法，但对于一些特殊类型的不发生DNA断裂的细胞Ap可能缺乏诊断价值。
2.3.2 流式细胞仪观察法 此法系通过荧光色素如PI、Hoechst等亲DNA的特性分析悬浮细胞DNA含量的直方图来达到判断细胞Ap的目的［6、9］。①PI染色法：Ap细胞经PI染色，流式细胞仪检测在正常细胞G1期的峰前增加一个特异性亚二倍体核型峰，即Ap细胞特有的Ap峰。此法优点是可以定量，灵敏度高；缺点是不能观察S期和G2期凋亡的细胞，不能区别死细胞和活细胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI法的不足。Hoechst可被活细胞摄取，与DNA结合呈蓝色荧光；PI使死细胞呈红色荧光。因此，在直方图上可以根据红蓝两种荧光判断三种细胞。正常细胞呈弱蓝、弱红光；Ap细胞呈强蓝、弱红光；坏死细胞呈弱蓝、强红光。
2.3.3 DNA末端标记法 利用Ap细胞在核酸内切酶的作用下，DNA断裂产生粘性末端的原理，用外源修饰化的核苷酸对这些断裂的DNA 3′末端用原位切口平移法或原位末端标记法进行标记，再用免疫学的方法对Ap细胞进行定量、定位测定。所用标记物包括生物素［10］、地高辛、荧光素［11］，用标记上这些物质的核苷酸与组织切片、细胞涂片或悬浮细胞进行处理，处理后可直接通过荧光显微镜或流式细胞仪观察；也可再加上酶标记的抗地高辛抗体、抗荧光素抗体或酶标记亲和素及相应底物用光学显微镜观察。
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