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三氧化二砷诱导人胃癌细胞株MGC |
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品。其它试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MGC-803细胞以含10%灭活的胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素10 mg/ml的RMPI 1640为培养基，在5%二氧化碳，37 ℃细胞培养箱内培养；细胞融合贴壁，单层生长铺满培养瓶后，以0.25%胰蛋白酶消化，常规传代培养，每3～4d传代一次。
1.2.2 MTT细胞活力分析 将0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液的MGC-803细胞，用含10%胎牛血清RMPI 1640培养基稀释调整细胞密度为3×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔加200μl的细胞悬液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内培养12 h，待细胞贴壁良好时，将浓度分别为10-8，5×10-8，10-7，10-6M的As2O3加入每孔中。对照组加PBS溶液，37 ℃，5%二氧化碳温箱内分别培养12，24，48 h，然后每孔加入10 mg/ml的MTT(1640培养液溶解)20 μl，同样条件保温4 h，取出培养板每孔加200 μl的二甲基亚砜，混匀，酶标仪测定570 nm吸光值。
1.2.3 流式细胞仪(Fcm)分析 将经10-8，10-6M浓度As2O3处理12～48h和未经砷处理的对照组MCG-803培养细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×105/ml，分别加入Hoechst33342和PI至终浓度为5μg/ml，37 ℃温育15 min后，离心6 min(500 r/min)后沉淀，予冷PBS漂洗，再沉淀，重悬于2 ml PBS中，立即在以紫外光为激发光源的Fcm(Lysis。USA)进行检测，分别用480 nm和600 nm的滤光片测量Hoechst33342和PI的蓝色和红色荧光，以及600/480的荧光比率，其相关参数由LYSIS软件自动分析处理。
1.2.4 DNA电泳 收集10-8，10-6M浓度As2O3处理24 h后和对照组MGC-803细胞予冷PBS冲洗一次，离心6 min(500 r/min)沉淀，加入2 ml的细胞裂解液(50 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，150 mM NaCl，1% SDS)，然后加蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，50℃水溶4 h，冷却至室温后，加入-20 ℃无水乙醇，可见DNA白色沉淀析出，离心沉淀10 min(12000 r/min)，小心吸去上清液，70%乙醇洗一次，重沉淀，风干，溶入400 ml TE缓冲液中，加入RNA至终浓度为200 mg/ml，37 ℃，20 min，然后置含溴化乙啶(EB)mg/ml的1.5%琼脂糖上，DNA分子量标准为λDNA经Hand Ⅲ和Ecor Ⅰ消化酶切(Promega产品)，电泳缓冲液为：0.5×TBE，电压为5 V/cm，电泳4 h，紫外灯观察并摄相。
1.2.5 扫描电镜样品制备 生长于小盖玻片上的经As2O3处理和对照组的细胞，以冷PBS液洗净，然后以1.5%戊二醛，1%锇酸固定各2 h，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐级脱水。乙酸异戊醛置换，临界点干燥，喷镀，安置，扫描电镜下观察，摄像。
2 结果
2.1 不同浓度As2O3对MGC-803细胞生长增殖的影响 用10-8，5×10-8、10-7，10-6M浓度的As2O3分别处理培养生长良好的MGC-803细胞6、12、24、48 h，MTT细胞活力分析显示MGC-803细胞实验组存活细胞明显低于对照组，且具有一定的时-效和量-效关系。10-8、10-7M的As2O3作用6 h，对MGC-803细胞生长抑制作用不明显，但随作用时间延长及作用浓度增加，细胞生长抑制效应逐渐增强呈量—效，时-效关系。详图1，所得结果为三次实验所测得的平均数据(±s)。
图1 不同浓度的As2O3对MGC-803细胞生长存活的影响
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