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体内体外联合免疫法制备抗鼻咽癌单克隆抗体 |
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细胞按2:1比例混合，在50%聚乙二醇(PEG，MW1500，BDH Chemical Co.)作用下融合。融合的杂交细胞配成30 ml的DMEM 细胞悬液，平均分配于三块96孔板，于次日半量换含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的HAT选择培基。以后每2～3 d给培养孔半量换液，二周后用HT培基。取杂交瘤生长的上清液用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选。阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，当克隆孔的阳性率达100%时，扩大培养，液氮保存。
1.3 鼻咽癌单克隆抗体的特异性鉴定
1.3.1 ELISA法 采用8株细胞，其中3株鼻咽癌细胞(HNE2，HNE3，CNE2)，2株大肠癌细胞(HRT-18，LS174T)；肺癌细胞(A549)，宫颈癌细胞(Hela)，正常成纤维细胞(HEL)各1株。上述细胞接种于96孔培养板，每孔约5×104个细胞。当细胞贴壁形成单层细胞后用0.15%戊二醛溶液固定10 min，PBS洗三次，用1%牛血清白蛋白封闭后，加杂交瘤上清，37 ℃孵育2 h或4℃过夜，然后加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的IgG+IgA+IgM(Zymed Lab. Inc. USA)，37 ℃作用2 h，再加0.03% H2O2的ABTS 底物溶液显色20 min，EL309型酶标仪(Bio-Tek Instruments，Inc.)测OD405。
1.3.2 免疫组化 石蜡组织切片经二甲苯脱蜡，依次经100%，95%，75%乙醇水化后，用0.5%H2O2甲醇溶液阻断内源性过氧化酶活性，加20%正常兔血清作用20 min，再加杂交瘤培养上清37 ℃ 2 h或4 ℃过夜。PBS洗后，加辣根过氧化酶标记的兔抗鼠IgG+IgA+IgM，37 ℃作用30 min。PBS洗三次，加底物DAB显色5 min，蒸馏水终止染色。切片经苏木素复染、盐酸分色、碳酸锂蓝化后，乙醇脱水、二甲苯透明，中性树脂封片、镜检。以PBS作为阴性对照。
1.3.3 抗体类型鉴定 将杂交瘤培养上清5倍浓缩后，用双向免疫扩散方法鉴定抗体类型。
2 结果
2.1 鼻咽癌杂交瘤细胞株的建立 经过腹腔基础免疫后，抗HNE2的抗血清效价为1:1 000，取其脾细胞加细胞因子、丝裂原和特异性抗原在体外进行免疫诱导，虽然细胞总数无明显增多，但淋巴母细胞的比例显著增多。与SP2/0细胞融合，有88.5%的细胞培养孔产生了杂交瘤，每孔上清应用细胞抗原HNE2进行间接ELISA筛选，获得10 株稳定分泌抗靶细胞抗体的杂交瘤，命名为HNL1～HNL10。对这10株细胞进行二次有限稀释，克隆化。
2.2 细胞株选择性检测 10株杂交瘤细胞系的单克隆抗体对7株癌细胞和正常成纤维细胞的ELISA检测，其结果见表1。ELISA结果显示:HNL1、HNL5 除对一株大肠癌细胞呈阳性反应外，对其他肿瘤细胞和正常细胞均为阴性，而对三株鼻咽癌细胞呈强阳性或阳性反应，说明HNL1和HNL5具有较好的选择性。
表1 10株鼻咽癌单抗的酶联免疫反应*
细胞株 HNL1 HNL2 HNL3 HNL4 HNL5 HNL6 HNL7 HNL8 HNL9 HNL10
HNE2 +++ +++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ ++ ++
HNE3 +++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ +++ +++
CNE2 ++ ++ ++ ++ +++ + +++ +++ ++ +++
Hela - ++ - + - - ++ ++ - +
A549 - +++ - + - + ++ + - +
HT29 - + - - - - + + - ++
LS174T + ++ ++ + + + ++ ++ + +
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