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荧光探针诊断结核性胸腔积液的临床价值 |
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陈嘉馨
胸腔积液大多是由结核所致,通常的检测方法为胸腔积液涂片和培养,但大多检出率低、周期长,不利于早期诊断和鉴别诊断。近年来,随着分子生物学基因诊断技术进入临床细菌学诊断实验室,因其敏感性高、特异性强、高效、简便、快速等优点,已被广泛应用于多个领域。我们运用FQ-PCR检测胸腔积液中结核杆菌DNA,旨在探讨其临床诊断价值。
1 资料与方法
1.1 病例选择 全部病例均为呼吸内科住院患者,其中男性42例,女性26例,平均年龄(37.2±5.6)岁。结核组诊断标准:①临床症状、体征典型,胸腔积液检验符合结核性指标。②肺部有活动性病灶。③结核菌素试验(PPD)1∶10 000。④胸腔积液中发现结核杆菌。⑤抗痨治疗有效。符合3点可诊断。非结核组经临床确诊或有病理依据,其中癌性胸水18例,化脓性胸膜炎11例。
1.2 试剂和仪器 TagDNA聚合酶及5′-3′外切核酸酶活性dNTP。两条引物:INS-1,5′-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3′,INS-2,5′GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3′。一条荧光标记的基因探针。荧光标记探针根据碱基配对原理与扩增序列结合,完成聚合。以上均由中山医科大学达安基因诊断中心提供,PCR仪为美国Perkin Elmer(PE)公司生产的全自动荧光定量仪。
1.3 方法 取胸腔积液2ml,加生理盐水1ml,离心后加提取液50μl后混匀,于100℃浴10分钟,取5μl加入反应管中,向反应管加入样品或质控标准品2μl,震荡、离心,于33℃,1分钟后迅速用DA620在特定波长下检测其初始荧光值A0。然后放入扩增仪进行DNA片段的扩增。扩增结束后,同样于33℃,1分钟后迅速用DA620在特定波长下检测其最初荧光值A0,然后放入扩增仪进行DNA片段扩增。扩增结束后,同样于33℃,1分钟后迅速用DA 620在特定波长下检测其最末荧光值A1。根据质量控制管A0－A1的值作标准曲线,然后将样品的A0－A1的值从标准曲线上查出相应的结果。
1.4 胸腔积液涂片及培养 胸腔积液离心取沉淀按常规方法涂片作Z-N抗酸染色,结核菌培养及菌型鉴定按照中国防痨协会结核病细菌学检查方法规程进行。
1.5 统计学方法 计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有显著性意义。
2 结 果
对68例各种胸腔积液标本同时进行3种方法检测,结果见表1。
表1 68例胸腔积液检查结果
组别 例数 涂片 培养 FQ-PCR
(+) (-) (+) (-) (+) (-)
结核组 39 3 36 2 37 25
14
非结核组 29 0 29 0 29 1 28
结果表明,39例结核性胸腔积液中,涂片、培养、FQ-PCR检出的阳性率分别为7.69%、5.13%和64.10%。经χ2检验,FQ-PCR检测法与涂片法比较(χ2＝24.57)P<0.005;FQ-PCR检测法与培养法比较(χ2＝20.4)P<0.005,结果均具有极显著性差异,其特异性为96.6%;3份涂片及2份培养阴性的标本,FQ-PCR检验均为阳性。
3 讨 论
传统的结核病细菌学诊断法为抗酸染色镜检和分离培养。抗酸染色镜检至少每1ml标本中有104～105个结核杆菌方可检出,检出率为30%,培养至少每1ml标本中有103～104个结核杆菌,才能检出,且需时为4～8周［1］。因此,多年来国外学者一直在寻找快速、敏感、高效、简便的实验室诊断方法。PCR的敏感性和特异性的提高,检测周期缩短(一般6小时可出结果),已越来越受到人们的重视。它以分析结核分枝杆菌的遗传物质核酸为基础,可检出1pg～100fg人型结核分枝杆菌DNA,检出率可达43.3%［2］,但PCR产物需经过琼脂糖凝胶电泳和紫外检测,需多种仪器,而且步骤冗长,费力费资金,且使用强致癌物(溴化乙锭EB),影响操作者的健康,同时电泳方法还限制了大规模普查的速度。近几年国外报道将碱性磷酸酶(AP)显色系统和辣根过氧化物酶(HRP)显色系统底物,换成一种经酶促分解后可产生光子的发生底物,若加入发光增强剂,可使发光强度增加1 000倍,即为荧光信号［3］。FQ-PCR是DNA探针技术和[1] [2] 下一页
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