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运动对糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体及葡萄糖运载体的影响 |
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功能异常是引起胰岛素受体后抵抗的重要原因之一〔2〕。骨骼肌组织是机体利用葡萄糖最主要组织，也是糖尿病发生胰岛素抵抗主要部位之一。运动训练可以改善糖尿病骨骼肌细胞葡萄糖代谢，增加外周组织对胰岛素的敏感性。然而对其作用机制目前尚未明了。本实验通过观察糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素受体结合力及GLUT4基因表达的变化，进一步明确糖尿病发生胰岛素抵抗的机制；同时观察有规律的运动训练对其影响，从受体水平及受体后水平探讨运动训练增加糖尿病大鼠外周组织对胰岛素的敏感性，改善糖代谢紊乱的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性Sprague-Dawley大鼠(体重180～220g)，随机分为3组：一组为正常对照组，另两组先制备成糖尿病模型，然后分为糖尿病运动组和糖尿病非运动组。糖尿病模型制备方法：大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.2) 55mg/kg体重。3天后测尿糖和血糖，尿糖在+++和++++，血糖在16.7mmol/L以上者确定为糖尿病；正常对照组大鼠腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲剂。
糖尿病运动组大鼠确定为糖尿病后，进行6周游泳训练。训练的方法按Ploug报道的方法〔3〕：水温保持35℃，水深50cm,每个大鼠有200cm2的活动表面积，前2周每天游泳40min，以后维持每天游泳60min，每周游泳5天，连续游泳训练6周。大鼠最后一次游泳训练结束后48h，尾静脉采血，麻醉处死，快速分离双侧后肢骨骼肌，用于测试骨骼肌细胞膜胰岛素受体结合力或GLUT4基因表达。另二组大鼠除不运动外，处置方法相似。
1.2 实验方法
1.2.1 实验第一步：各组用10只实验大鼠作骨骼肌细胞胰岛素受体结合力的观察。
骨骼肌细胞膜制备：按改良的Klip的方法〔4〕，将骨骼肌组织在50mM Tris-HCl溶液中剪碎，在匀浆器中制成匀浆，进行离心、过滤，重复1次，提取膜蛋白。 膜蛋白浓度测定用Lowery方法〔5〕。
胰岛素结合力测定：按改良的Nishimura方法〔6〕，在试管中加入100μl细胞膜(含100μg膜蛋白)，100μl 50mM Tris-HCl 含有和不含单组分猪胰岛素30μg, 100μl125I-胰岛素, 于4℃ 冰箱中反应16h，加入含0.1% BSA的50mM Tris-HCl溶液1ml，离心30min，再用上述缓冲液洗涤一次，重复离心，沉淀用γ计数仪计数。非专一性结合量为在含有非标记胰岛素存在下的结合计数，专一性结合量为总计数减去非专一性结合计数。
1.2.2 实验第二步：各组用6只实验大鼠作骨骼肌细胞GLUT4基因表达的观察。
质粒DNA的提取和探针的标记：含大鼠全长GLUT4 cDNA的Bluescribe重组质粒(2086bp,由美国华盛顿大学Mueckler Mike 教授赠)，经菌株扩增后，用改良碱裂解法提取和纯化质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳回收GLUT4 cDNA探针，用随机引物法同位素标记GLUT4 cDNA探针。
斑点印迹杂交实验：采用一步快速热酚法抽提骨骼肌细胞总RNA〔7〕。取15μg总RNA，经甲醛变性后，点样于处理好的硝酸纤维素滤膜上，然后预杂交、杂交、洗涤及放射自显影。用Vectron计算机图像分析系统对斑点杂交结果进行光密度扫描，以正常对照组为100，其它组计算相对含量。
对3组大鼠(每组6只)测实验前后体重、尾静脉血糖和血清胰岛素的变化。血糖浓度用快速血糖仪测试，血清胰岛素浓度用放免法测定。
1.3 统计学处理
实验数据用均数±标准差表示，组间显著性差异采用t检验。
2 结果
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