|
骨骼肌细胞葡萄糖运载体4的实验研究 |
| |
身葡萄糖利用的最主要组织，也是胰岛素介导葡萄糖进入细胞内的重要部位，约占整个葡萄糖转运的90％ （脂肪组织只占5％左右）,并且是糖尿病胰岛素受体后抵抗的主要部位〔3〕。因此，对骨骼肌GLUT4的研究有很重要意义，本研究的目的是制备GLUT4的多克隆抗体，然后用Western印迹法对正常大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜GLUT4蛋白的分布进行检测，为进一步研究糖尿病的病理机制和治疗机制打下基础。
1 材料和方法
1.1 多克隆抗体的制备
参照James方法〔4〕，采用Merrifield固相合成法制备GLUT4羧基端13肽（Cys-Thr-Glu-Leu-Glu-Tyr-Ile-Gly-Pro-Asp-Glu-Asn-Asp），以灭活的伤寒杆菌菌壳为载体，用福氏完全佐剂乳化，制备免疫原免疫兔子，每两周免疫1次，用ELISA法测血清抗体滴度，获满意结果后，处死兔子取血清，经饱和硫酸铵沉淀，透析，冷冻干燥，得GLUT4多克隆抗体干粉。
1.2 大鼠骨骼肌细胞内膜和外膜的分离
用改良Klips方法〔5〕制备大鼠骨骼肌细胞内外膜。大鼠断头处死后，取后肢大腿肌肉，浸至0℃溶液A（250mm Sucrose, 50mm Tris,0.2mm EDTA）中，剔除血管、脂肪及筋膜后，剪碎，匀浆，匀浆液以9000g 高速离心10min（4℃），保留上清，沉淀如上再匀浆、离心，两次上清以19000g超离心1h，取沉淀铺于25％、30％、35％的蔗糖梯度上，15000g超离心16h。于25％蔗糖层上得到细胞外膜，35％层上得到细胞内膜，用改良Lowry法〔6〕测蛋白浓度，测定细胞内膜和外膜的蛋白含量。
1.3 GLUT4的检测
取骨骼肌细胞内膜和外膜各100μg进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，再与含5％脱脂奶粉的PBS 水浴摇床温育1h(37℃)，再与GLUT4多克隆抗体反应过夜(4℃)，洗涤后与HRP标记的羊抗兔IgG 温育2h(37℃)，充分洗涤后与ECL(增强化学发光剂，美国Amersham公司)反应1min，即刻与Kodak底片曝光，洗片后进行扫描、定量(岛津双波长薄层扫描仪)。
2 结果
2.1 制备得到的GLUT4多克隆抗体具有高效价
见表1。
2.2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
见表2。通过梯度离心法获得细胞内膜和外膜的的总蛋白量不同，细胞内膜的总蛋白量大大超过细胞外膜的总蛋白量，约为细胞外膜的8倍。
表1 4只兔子产生的多克隆抗体的效价比较
兔子编号 抗体滴度 免疫次数
1 1∶25600 3
2 1∶25600 3
3 1∶51200 3
4 1∶51200 3
5 1∶51200 2
表2 骨骼肌细胞内膜和外膜蛋白含量的比较
体积
(ml) 蛋白浓度
(mg/ml) 蛋白含量
(μg/g组织)
细胞内膜 2.40 7.8 418
细胞外膜 0.33 6.3 51
2.3 细胞内膜和外膜GLUT4蛋白含量的比较
在相同蛋白量时（同为100mg蛋白）细胞内膜和外膜上GLUT4蛋白量无显著差异(P＞0.05)（见图1、2)，而实验中所得到内膜的量约为外膜的8倍，故在基础状态下，内膜GLUT4蛋白的含量大于外膜。
图1 Western blot 法检测大鼠骨骼肌细胞内、
外膜上GLUT4
图2 相同蛋白量时(100μg)，骨骼肌细胞
内膜和外膜GLUT4含量的比较
3 讨论
细胞内膜是细胞器膜和核膜的统称，其作用是把原生质分成既互相隔离、互不干扰，又互相关联、彼此依存的多相微环境。由于内膜和外膜的密度不同，内膜的沉降系数大于外膜，可通过梯度离心方法将其分离。Klip的实验〔5〕表明，将细胞粗膜进行蔗糖梯度的超速离心，在25％的蔗糖浓度层收集的细胞膜富含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞外膜，而在35％层收集的细胞膜不含5-核苷酸酶和Mg2+-ATP酶，确定为细胞内膜，主要是以微粒体为主。本实验参照Klip的实验方法进行骨骼肌细胞内外膜的分离，表明细胞内膜的含量大大超过外膜的量（上一页 [1] [2] [3] 下一页
上一个医学论文： 颈后伸对椎动脉流速影响的研究及意义
下一个医学论文： 外伤性脾损伤的非手术治疗
|
|
|
|
|
|
|
您现在的位置： 绿色健康网 >> 医学论文 >> 临床医学论文 >> 正文