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15例DMD BMD外显子缺失与临床关系研究 |
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吕佩源 杨康女 郭宗成 郝玉宾 张微娜 朱俊真
【摘 要】 目的:探讨Duchenne/Becker型进行性肌营养不良症(DMD/BMD)致病基因外显子缺失的分布特点及其与临床表现的关系。方法:利用9对引物以多重PCR技术,对临床诊断的DMD/BMD患者抗肌营养不良蛋白基因进行检测。结果:共发现15例患者外显子缺失,主要分布在中央缺失热区和5′端缺失热区,其中以45、48号外显子缺失最多见,且缺失片段长度各异。结论:①外显子缺失的表达也受到个体差异的影响,呈高度的遗传异质性。②该病病情轻重可能与外显子缺失的数量及片段大小不呈平行关系,而与某些外显子缺失有关。
【关键词】 肌营养不良 聚合酶链反应 基因 外显子▲
分子遗传学研究表明,Duchenne型肌营养不良症(DMD)和Becker型肌营养不良症(BMD),是一种常见的X连锁隐性遗传病。抗肌营养不良蛋白基因的异常,导致其所编码的肌细胞膜骨架蛋白抗肌营养不良蛋白的合成障碍,引起肌细胞变性和坏死。近年来,随着PCR技术在临床的广泛应用,直接检测致病基因为临床确诊DMD/BMD提供了可靠的依据。本文对15例外显子缺失的DMD/BMD患者突变基因的分布特点及其与临床病情的关系进行探讨。
1 资料与方法
1.1 病例选择 33例检测对象为临床诊断的DMD/BMD患者,全部为汉族,男性,均来自我院神经内科,其中DMD 31例,BMD 2例;有家族史者4例,余均为散发;全部患者均有典型的临床表现,并经肌电图、血清肌酶酶谱检查证实;另外,部分患者经肌肉活检证实。
1.2 试剂来源 9对DMD/BMD引物多重PCR试剂盒购自北京中国医学科学院基础研究所,5对引物单一PCR试剂盒购自湖南医科大学国家重点医学遗传实验室。
1.3 方法
1.3.1 人基因组DNA制备 抽取抗凝(2%无菌EDTA)静脉血5ml,加入破膜液,37℃20分钟,离心3000r/min,15分钟,弃上清,加入3ml破核液和蛋白酶K,55℃消化4小时或37℃过夜,加入等体积饱和酚抽提,取上清在加入等体积1∶1=酚∶氯仿抽提,吸取上清加入2～3倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA,DNA用75%乙醇洗2遍,干燥后溶于TE buffer。用751紫外分光光度计测OD值,计算浓度与纯度。
1.3.2 PCR扩增 9对引物分成5对引物和4对引物两组,在50μl反应体系中加入:模板200～500ng,10×buffer 5μl,dNTP(25mM,each)4μl,TMAC 5μl,BSA(10μg/μl),5对/4对引物混合物8.5μl(25pmol,each),最后加水至50μl,混匀后离心数秒,至97℃预变性7分钟,离心15秒,迅速置冰上,加入Tag酶2.5U,混匀后加30μl液体石蜡,放入PCR仪中进行扩增。扩增条件为:94℃30秒,56℃30秒,70℃2分钟30个循环,最后70℃延伸5分钟。
1.3.3 结果判断 取15μl扩增产物加入溴酚蓝载样缓冲液2μl,电泳60～80V2小时,以正常男性模板扩增产物为对照,5条/4条扩增带都存在为正常。缺失任何一条带,经重复扩增后结果相同,诊断为基因缺失型DMD/BMD。
2 结 果
本组15例外显子缺失特征见表1,其中13例仅存在1个外显子缺失,2例存在2个外显子(分别为44,45和44,49)缺失。缺失的外显子片段最长者为45号(547bp),最短者为4号外显子(191bp)。
缺失的外显子分布情况,累及中央缺失热区(44～53号外显子区)者检出率76.5%,5′端缺失热区(3～19号外显子区)为23.5%;其中以45,48号外显子缺失最多,各占4例;4,44和51号各2例。
表1 15例DMD/BMD外显子缺失特征
序号 临床诊断 发病年龄(岁) 缺失外显子 片段长度(bp)
1
DMD 5
45
547
2 BMD 23 #17 271
3 DMD 4 48 506
4 DMD 7 # 8 360
5 DMD 8 # 4 191
6 DMD 10 44,45 268,547
7 BMD 30 48 506
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