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实验性过敏性脑脊髓炎中细胞因子的免疫组化研究 |
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crosis factor-α Interferon-γ▲
实验性过敏性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)是T细胞介导的中枢神经自身免疫性疾病，在病理改变方面与多发性硬化有很多相似之处，是研究多发性硬化症的经典性动物模型，而致炎性细胞因子作为免疫介导性物质在神经系统炎性脱髓鞘病的发病及病程进展中发挥重要作用。尽管目前对EAE血液中的细胞因子研究较多，但蛋白水平的表达研究较少，本研究采用免疫组化方法对EAE发病过程中脑和脊髓中部分致炎性细胞因子进行了动态研究，目的在于探索致炎性细胞因子在神经系统脱髓鞘病中的作用。
材料和方法
一、实验动物
二级实验用雌性Hartley豚鼠30只(购于中国医学科学院实验动物中心)，6周龄左右，体重180～230g，随机分为6组，分别为对照组和实验1～5组，每组5只。
二、EAE的诱发
动物购回3天适应后，采用自提牛脊髓髓鞘碱性蛋白(myelinbasic protein, MBP)加等量完全福氏佐剂进行免疫，MBP和佐剂充分乳化后注射于右后足蹼皮下，每只注射MBP100μg。对照组用等量完全福氏佐剂加生理盐水免疫。
三、抗体
采用抗蓖麻凝集素RCA-1(VECTOR)标记小胶质细胞，抗体稀释度1∶300；抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(DAKO)标记星形胶质细胞，抗白细胞介素(interleukin,IL)-1β、抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α(T5)和干扰素(interferon,IFN)-γ单克隆抗体均为军事医学科学院产品(购于邦定公司)，抗体稀释度均为1∶300。
四、实验方法
1.观察时间：为了观察小胶质细胞和星形胶质细胞在EAE临床发病前的变化，根据EAE模型注射MBP至发病的平均潜伏期(8天)，将实验1组和实验2组的观察时间分别定为动物免疫后第3天(发病前5天)和第5 天(发病前3天)；实验3组为发病第1天(发病初期)；实验4组为发病第5天(发病高峰期)；实验5组为发病后2周(恢复期)。
2.标本采集：动物用10%的水合氯醛400mg/kg麻醉后，立即暴露心脏，经左心室插管至升主动脉，然后快速灌注肝素化生理盐水150ml，随后灌注4%多聚甲醛(0.1mol/LPB)800ml，灌注时间约1小时。最后取脑和脊髓置20%蔗糖(0.1mol/L PB)中保存。
五、免疫组化染色
全脑及胸腰段脊髓标本采用Leica冷冻切片，厚度50μm，每隔250μm切片1张。采用免疫组化漂染法染色，标本先置3%过氧化氢PBS溶液5分钟，以消除内源性过氧化物酶，然后用0.01mol/L PBS洗净；置0.3%的Triton-100 PBS 40分钟，以消化细胞膜暴露抗原；0.01mol/LPBS洗涤后，加5%山羊血清封闭无关抗原；加适当稀释的一抗，4℃48小时；0.01mol/L PBS洗涤3×5分钟后，加1∶300生物素标记的抗鼠或抗兔IgG(Santa Cruz)，室温2小时(抗RCA-1染色不经过此步骤)；0.01mol/L PBS洗涤3×5分钟后，加1∶300 HRP标记卵白素(Santa Cruz)，室温2小时；0.01mol/L PBS，洗涤3×5分钟后，用Ni-DAB-葡萄糖氧化酶显示系统显色；用1%的明胶贴片，晾干后梯度酒精脱水、二甲苯透明，封片观察。
显色液配制：0.1mol/L pH5.8醋酸缓冲液100ml加入硫酸镍胺4g、葡萄糖200mg、氯化氨40mg、DAB 50mg(Sigma)，过滤后，加葡萄糖氧化酶0.8mg(Sigma)。
结果
用生理盐水加完全福氏佐剂的对照组无一发病，实验3～5组每组至少有4只豚鼠发病。发病前1～2天出现食欲减退，潜伏期8天左右，潜伏期短者，病情较重。多数动物遵循以下发病规律：发病第1天出现双后肢轻度无力、行动迟缓；发病第2、3天后肢无力明显加重，并出现双前肢无力尿失禁；发病4～6天病情达高峰，此时动物四肢瘫痪、进食困难、体重明显下降，部分出现全身震颤或意识障碍；发病第7天后，动物开始逐渐恢复。
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