霉素为刺激原，加蛋白转运抑制剂后培养，裂解红细胞后洗涤后弃上清，CD4FITC单抗标记洗涤，加4%多聚甲醛固定， 0.1%Triton X100缓冲液破膜加入IFNγPE、IL4PE，室温孵育,充分洗涤后用PBS2%多聚甲醛悬浮细胞，应用EpicsXLⅡ型流式细胞仪进行检测，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm,应用Expo32ADC进行免疫荧光分析。将CD4+IFNγ+ T细胞认为Th1细胞、CD4+IL4+ T细胞认为Th2细胞，Th1/Th2比值代表机体的免疫平衡状态。同法检测对照组外周血Th1、Th2细胞和Th1/Th2细胞比值。
1.5 酶联免疫吸附法检测IFNγ、IL4血清浓度
严格按照说明书进行操作。
1.6 Colon26/IL21细胞株IL21基因的表达测定
取生长旺盛的Colon26/IL21细胞，加入Trizol溶液裂解细胞，加入氯仿振荡后静置。低温离心后取无色上层水相，加入0.5 ml异丙醇混匀静置，加入 75%乙醇，得到总 RNA(同法提取Colon26细胞总RNA)。用紫外分光光度计测定RNA的OD260 nm、OD280 nm数值。求出OD260 nm/OD280 nm比值以鉴定RNA纯度。分别取Colon26/IL21及Colon26细胞总 RNA，于琼脂糖凝胶中电泳，分析RNA完整性。分别以提取的Colon26/IL21细胞及Colon26细胞总RNA为模板，依次RNA 1.5 μl、上游引物0.9 μl、下游引物0.9 μl,酶反应混合物2 μl、MgCl2 1.0 μl、dNTP 1.2 μl。置PCR扩增仪扩增IL21 DNA。反应条件为：cDNA第一链合成37℃ 50 min;灭活反转录酶94℃ 5 min;然后进行下列循环：变性94℃ 45 s，复性66℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，循环数25;再延长72℃ 5 min。将Colon26/IL21细胞及Colon26细胞RTPCR扩增产物作电泳，观察各细胞株IL21表达的情况。
1.7 Colon26和Colon26/IL21细胞接种后肿瘤生长情况对比
取90只Balb/c小鼠，随机分为3组，每组30只，分别为Colon26组、Colon26/IL21组和空白对照组。Colon26组和Colon26/IL21组分别于小鼠爪垫内侧皮下接种Colon26细胞Colon26/IL21细胞悬液0.04 ml(5×105个细胞);空白对照组同部位注射生理盐水0.04 ml。观察爪垫肿瘤生长情况，每隔48 h测量并记录肿瘤体积(肿瘤体积的计算公式为1/2×长×宽2)。将小鼠爪垫每次肿瘤体积观测值取平均值，绘出爪垫肿瘤体积变化曲线。于接种第24天时取血1 ml后处死，完整剥离肿瘤，称重测量Colon26组和Colon26/IL21组小鼠爪垫肿瘤重量。肿瘤组织用10%中性甲醛固定，HE染色观察接种肿瘤组织细胞学差异。
1.8 统计学方法
应用SPSS13.0软件进行两样本间的t检验和单因素方差分析。
2 结果
2.1 外周血Th1、Th2细胞及Th1/ Th2比值的测定
测定30例结肠癌患者和30例正常人的Th1细胞数目无明显差异;结肠癌患者Th2细胞比例升高，导致机体Th1/ Th2平衡向Th2型偏移。见图1。结肠癌患者IFNγ的测定值较正常人明显降低，IL4的测定值则显著升高， IFNγ/IL4比值有显著差异(P<0.01)，说明大肠癌患者较正常人细胞免疫力下降、免疫平衡向Th2型偏移。见表1。表1 两组患者外周血中Th1、Th2细胞、IFNγ、IL4检测及免疫平衡状态比较(略)
2.2 Colon26/IL21细胞株基因表达测定
Colon26/IL21细胞经RTPCR扩增所得产物在434 bp附近形成特异性条带，说明Colon26/IL21细胞株有IL21 mRNA稳定表达。见图2。
2.3 接种Colon26小鼠和Colon26/IL21小鼠肿瘤生长情况测定
小鼠接种Colon26、Colon26/IL21细胞后于爪垫均逐渐形成肿瘤。接种Colon26细胞组肿瘤持续增大，接种Colon26/IL21细胞组肿瘤于16 d达到平均体积1.3 mm3，然后逐渐缩小，两组肿瘤体积变化曲线。见图3。24 d时处死小鼠后两组肿瘤称重结果，两组肿瘤平均重量分别为(2.48±0.3
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