台盼兰染色肿瘤细胞化学药物敏感实验的临床应用价值

　　表1 两组病人的临床资料比较(略)

　　1.3 方 法

　　1.3.1 大肠癌切除术后，取肿瘤组织标本，在无菌条件下，剥离肿瘤组织的纤维、脂肪层及结缔组织。

　　1.3.2 用生理盐水将肿瘤组织清洗，再用头孢噻肟钠溶液(头孢噻肟钠4.0+生理盐水)清洗。

　　1.3.3 用剪刀将肿瘤组织尽可能剪成小碎块，过200目钢网后放入肿瘤组织解离酶液中，以1500r/min条件下离心20min，弃去上清液。

　　1.3.4 以PRMI-1640制成癌细胞悬液，在显微镜下计数，调整细胞浓度至20～40万/ml。

　　1.3.5 分别取2ml癌细胞悬液各加入不同浓度的化疗药物CTX，DDP，5-FU，MMC。药物浓度(TDC)分别为200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%，保持总体积为3ml，在37℃，5%CO2，95%湿度下孵育3～4d;同时设无药对照组(M0组)，取2ml癌细胞悬液加与化疗药物同等剂量的培养基，保持总体积为3ml，同等条件下孵育3～4d。

　　1.3.6 用台盼兰染色计数各组的活细胞数。用品：①4g台盼兰，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，制成1%台盼兰母液。使用时，用PBS(磷酸缓冲液)稀释至0.4%。②吸管、白细胞计数板、显微镜。 步骤：①染色：取9滴癌细胞悬液移入小试管中，加1滴0.4%台盼兰液，混匀。②计数：在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞(镜下观察，死细胞淡蓝色，活细胞拒染)。据下式求活细胞率： 活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞总数)×100。

　　1.3.7 测定AUG、IC50、IC90、SI等指标。

　　1.3.8 确定敏感药物并选出最佳药物或药物组合，对病人进行化疗。(实验组，A组)。

　　1.3.9 对照组(B组)病人用常规药物化疗。

　　1.3.10 追踪观察病人(A组及B组)的近期效果，肿瘤的复发、转移、3年生存率、5年生存率，评估疗效。

　　1.4 结果评估：①药物敏感定义：高AUC(抑制曲线下面积)值，低IC90(抑制90%癌细胞生长是的药物浓度)、IC50(抑制半数癌细胞生长时的药物浓度)和SI(敏感指数)值，和高TGI(癌细胞生长抑制)值(表示癌细胞生存100%抑制)。②药物耐受定义：低AUC值，高IC90、IC50和SI值，和低TGI值。③敏感度分级，定义为：强敏感：IC90 ≤100%TDC(测试肿瘤药物浓度)和IC50≤ 25%TDC。部分敏感：IC90>100%TDC和IC50≤ 25%TDC。弱敏感：IC90≤100%TDC和IC50>25%TDC。耐药：IC90>100%TDC和IC50≤25%TDC。

　　2 结果

　　实验结果显示，不同个体的(大肠癌)癌细胞对四种化疗药物具有不同的敏感性。汇总见表2。

　　表2 药物敏感实验结果(n=30)(略)

　　随访至2007年12月，以Mantel-Cox和Broslow方法进行生存率比较。A组：1年、2年、3年、5年生存率分别是96%、83%、70%、43%。B组：1年、2年、3年、5年生存率分别是93%、73%、60%、33%。两组比较具有显著差异(P=0.0225)，见图1。

　　图1 A组和B组患者生存曲线(略)

　　3 讨论

　　3.1 台盼兰染色原理：细胞损伤或死亡时，台盼兰可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。注意：台盼兰染色细胞时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。

　　3.2 本实验的意义和优点：肿瘤细胞的增生与失凋亡之能力有关[1～5]，并且存在多种因素导致肿瘤细胞凋亡能力的丧失，逃避了凋亡肿瘤细胞对常规化疗药物耐药中所起的关键作用[6，7]。因此，寻找一种高效低毒的药物做为化疗或辅助化疗治疗肿瘤就是我们研究方向。本实验通过简易的化疗敏感实验确定对个体肿瘤细胞具有最佳疗效的化疗药物或药物组合。其意义在于：①选择和确定针对个体的敏感药物，提高疗效。②减少化疗的盲目性，避免无效药物对肌体的损害。③改善肿瘤病人的生存质量，延长生存期。④研发一种简便易行、费用低廉的实验方法以指导临床。本研究对癌症患者的癌细胞进行体外的有药培养，然后通过台盼兰染色检测细胞活性的有关指标，确定最佳药物及组合，具有以

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