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MAPK途径在大鼠肝干细胞增殖调控中的作用 |
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置于冰上作用30min, 用细胞刮取器刮下细胞, 4℃离心15000g离心,30min,上清即为总的细胞蛋白溶解成分。
1.5.2 比色法测定蛋白质浓度 分别在5ml离心管中加入0.2mg/ml牛血清白蛋白0、 50、 100、 200、 300、 400、 500, 以去离子水补足至500μl, 各管加入5ml考马斯亮蓝染色液,振荡混匀,测定A595, 取A595吸光值对标准蛋白浓度作图;测定待测样品的A595,从BSA标准曲线中确定其蛋白浓度。30μg 蛋白等量上样。
1.5.3 蛋白印迹 按常规方法进行SDS-PAGE,分离胶为10%;100转膜(经甲醇处理的PVDF膜),封闭1h, 用TBS-T洗一次5min, 置于兔抗鼠一抗 (用封闭液1:2000稀释)中,摇床上缓慢摇动1h,简单地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min,置于辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗 (用封闭液1:5000稀释)中, 摇床上缓慢摇动1h,简单地在TBS-T中漂洗2次,用TBS-T洗4次,每次10min。用ECL系统进行检测,将A液与B液等体积混合,配成发光剂,均匀地涂在PVDF膜上,1min后吸去发光剂,用保鲜膜将PVDF膜包裹,X线片压片,曝光20s~5min, 显影2min,定影5min。
2 结果
2.1 细胞因子对肝干细胞增殖的影响 我们用不同的细胞因子,以不同的浓度对WB细胞进行作用,24h后,用H3-TDR掺入法检测细胞因子对WB细胞体外生长的影响。发现,HGF对WB-F344细胞具有促进增殖作用,并具有剂量效应正相关(见图1)。注:纵坐标为H3-TDR掺入CPM值;横坐标为细胞因子剂量
2.2 HGF 刺激WB细胞信号转导途径的激活 ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt等信号途径可以被多种细胞生长因子激活, 参与介导细胞增殖、离散、抗凋亡及分化。在肝干细胞,HGF是否激活这些信号转导途径,从而参与细胞调控?为此我们将WB 细胞在含0.5%血清的培养液中饥饿 12h, 然后用 HGF (40ng/ml)刺激不同时间(0、5、15、30、60、120min),通过western blotting 检测 ERK、 p38MAPK、 Akt 信号分子及磷酸化ERK、 p38MAPK、 Akt(P-ERK,P-p38MAPK, P-Akt)。结果显示(见图2), 在WB细胞,HGF确实能够激活ERK、 p38MAPK、 PI3K/Akt途径。ERK 途径在HGF刺激 5min后发生磷酸化,并且完全磷酸化发生在HGF作用15min,1h后逐渐消失。 Akt作为PI3K的下游靶蛋白是一种多功能调节因子,参与细胞生存和凋亡的调控。 Akt 也在HGF作用5min后发生磷酸化, 15min后达到完全磷酸化并且持续至少2h。 P38 MAPK 途径也在 5min后开始激活,在 30min后逐渐减少,持续大约 3h。
2.3 MAPK信号途径在肝干细胞增殖调控中的作用 为明确MAPK途径在HGF介导的WB F-344细胞增殖中的作用,我们用特异的抑制剂(U0126 20M;SB203580 15 M)预处理WB细胞,分别阻断不同的信号途径,再用HGF(40ng/ml)刺激,24h后用H3掺入法检测细胞的增殖效应,发现用U0126、 SB203580 处理后能够明显减低HGF诱导的增殖效应,表明, ERK1/2和p38MAPK 途径的激活参与HGF介导的细胞增殖效应(见图3)。
3 讨论
细胞对于外界刺激的反应是通过信号之间的相互作用和交流进行的。当不同的信号进入细胞,细胞必须对多种信号进行平衡调节,最终作出一种适当的反应,如增殖、分化、生存或凋亡。蛋白激酶系列是细胞信号转导的重要介质,外界信号刺激后,可以触发多种蛋白激酶的级联活化,与各种信号相适应,传递并能够放大信号,从而在不同的时间将信号传导至不同的区域,维持不同的时间,并且产生多种及适当的反应方式[5,6]。
MAPK是一族胞浆内广泛分布的含有丝氨酸/苏氨酸残上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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