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MAPK途径在大鼠肝干细胞增殖调控中的作用 |
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KT pathways are not involved in HGF-induced proliferation.
【Key words】 hepatic stem cells; cell factor;signal conduction
MAPK是一族胞浆内广泛分布的蛋白激酶,包括细胞外调节蛋白激酶(Extracellular-signal Regulated Kinase, ERK)、P38-MAPK、c-JUN N端激酶(JNK)。在细胞的增殖、分化和生存中起着重要作用[1,2] ,多种增殖和抗凋亡信号通过MAPK的激活进行调控。它们参与细胞对各种信号的调节,触发级联性活化,在不同的时间将信号传导至不同的区域,产生如增殖、分化或凋亡等多种生物效应。
HGF是一种具有多种生物功能的细胞生存调节因子,能够介导细胞的增殖、离散及抗凋亡作用[1,2]。HGF的信号转导是通过其受体C-met的酪氨酸磷酸化而激发,HGF作用于c-met的β-亚单位C末端多功能位点,导致C-met和一些胞浆信号蛋白的相互作用,依次激活MAPK和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等信号途径[3,4]。在大鼠肝干细胞系WB F344细胞,HGF能够诱导明显的细胞增殖,然而HGF/met介导的信号系统在肝干细胞的传导机制还不十分清楚。
HGF诱导的肝干细胞的增殖作用是否也通过MAPK途径?这些信号途径如何参与肝干细胞的增殖调控?为此,我们的研究将探讨MAPK信号途径在HGF介导的信号转导中的调控。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 肝细胞生长因子Hepatocytes Growth Factor(HGF), 购自 Sigma. 不同信号途径的特异抑制剂均购自Promega 溶于 DMSO。 ERK 特异抑制剂U0126、 PI3K特异抑制剂Ly294002、 所用浓度均为 20μM。 p38 MAPK 特异抑制剂 SB 203580,所用浓度为15μM;ERK、p38MAPK,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体,ECL检测系统均为Santa Cruz 产品 。
DMEM为Gibco公司产品,胎牛血清为Life Technologies 公司产品,胰酶为Gibco公司产品, PMSF为Sigma公司产品, PVDF膜为Amersham公司产品。
1.2 主要仪器及设备 细胞培养箱:Heraeus;超净工作台:北京半导体设备一厂; 倒置显微镜:重庆光学仪器厂XDS-1;液闪仪:蛋白电泳仪及电转移装置:BIO-RAD 美国;成像仪:Stratagen Eagleeye II: 美国;可见/紫外分光光度仪:Beckman;PM-30自动照相系统:Olympus; Kodak Scientific Imaging Systems 软件分析系统。
1.3 细胞培养 大鼠WB-F344肝干细胞系,我所提供。
1.4 3H-TdR掺入DNA的方法来检测细胞的增殖细胞 细胞用胰酶消化,稀释细胞密度至50000细胞/ml,按每孔100μl接种于96孔细胞培养板,37℃5%CO2下培养24h,在含0.5%血清的培养液中饥饿24h, WB细胞用或不用各种特异的抑制剂(U0126 20 M;SB203580 15μM; Ly294002 20μM)预处理,然后加入HGF(40ng/ml)刺激24h, 每孔加入1.85×104Bq3H-TdR, 3h后收集细胞,以液闪计数表示刺激活性。
1.5 Western Blotting
1.5.1 细胞蛋白提取 WB细胞在含0.5%血清的培养液中饥饿12h,然后用HGF(40ng/ml)刺激不同时间(0、5、15、30、60、120min),收集细胞,用冰冷的PBS洗细胞3次,加入600μl RIPA裂解液(2×106 细胞),上一页 [1] [2] [3] [4] [5] 下一页
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