4个/孔种于96孔板, 分为对照组(静止T细胞); DC组(正常DC+T细胞); 食管癌匀浆上清组(食管癌匀浆上清诱导DC+T细胞); 癌旁匀浆上清组(癌旁匀浆上清诱导DC+T细胞); VEGFA组(VEGFA诱导DC+T细胞)。每组设6个复孔, 混合培养72 h, CCK8试剂盒检测T细胞增殖率。(3)致敏DC诱导特异性CTL的产生: 同种自体T细胞与各组致敏的DC按20∶1比例混合培养72 h, 激活为CTL。(4)细胞毒性实验: 将各组CTL和静止T细胞, 按效应细胞∶EC9706为30∶1比例混合, 分为靶细胞对照组(EC9706); 效应对照组(静止T细胞+ EC9706); DC组(DC诱导的CTL+ EC9706); D组: 食管癌匀浆上清组(食管癌匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706); 癌旁匀浆上清组(癌旁匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706); VEGFA组(VEGFA组DC诱导的CTL+ EC9706)。设每组6个复孔, 1×104个/孔细胞悬液200 μL种于96孔板, 培养72 h, CCK8法检测对EC9706细胞杀伤率。(5)CCK8检测: 加入10 μL/孔的CCK8试剂, 培养2 h, 于酶标仪450 nm处测各组A值, 计算T细胞增殖率和杀伤率。其计算公式如下: T细胞增殖率=实验组A值/静止T细胞组A值×100%; 细胞杀伤率=(效应对照组A值-实验组A值)/靶细胞对照组A值×100%。
1.2.8 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件, 进行两组OneWayANOVA分析, 以x±s表示。
2 结果
2.1 ELISA检测食管癌及癌旁组织匀浆上清VEGFA含量 检测15例食管鳞癌及癌旁组织匀浆上清液, 结果显示癌旁匀浆上清组A值0.203±0.089, VEGFA浓度0.152±0.105 μg/L; 癌上清组A值0.897±0.251, VEGFA浓度0.987±0.319 μg/L, 两组比较P<0.05, VEGFA含量有统计学意义。
2.2 形态学观察 PBMC去除悬浮细胞后, 镜下观察细胞贴壁, 体积小。诱导2 d, 部分贴壁细胞变形, 伸出小突起; 第4天, 正常DC组细胞表面突起更加明显, 并且交织在一起, VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞形态与正常DC组相似, 而食管癌匀浆上清组细胞形态变化较小, 仅有个别细胞伸出突起, 细胞体积小于正常DC组细胞; 第8天, 正常DC组、 VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞逐渐增大变圆, 高倍镜下细胞周围可见毛刺状突起, 部分细胞悬浮, 呈成熟形态, 而食管癌匀浆上清组大圆细胞少, 呈发育迟缓状态(图1)。
2.3 FCM检测细胞相关表面抗原 分离PBMC, 贴壁3 h, 去除非贴壁细胞, 检测DC诱导前PBMC相关抗原阳性率(%)CD80 13.92±3.60、 CD83 9.56±3.91、 CD1a 18.86±2.23、 HLADR 22.62±3.31、 CD86 38.64±4.05、 CD11c 7.31±2.67。第2天各组分别加入食管癌匀浆上清、 癌旁匀浆上清、 VEGFA, 诱导7 d后有关细胞表面抗原表达见表1。
2.4 RTPCR检测CD1a基因表达 正常DC组目的基因CD1a(601 bp)的表达较强, 食管癌匀浆上清组该基因基本无表达, VEGFA组与癌旁匀浆上清组CD1a表达与正常DC组无统计学意义, 内参基因GAPDH(915 bp)各组表达较一致(图2)。 表1 诱导后DC的免疫表型
2.5 致敏DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤效应 食管癌匀浆上清组诱导的DC刺激T细胞增殖率、 CTL杀伤率均明显低于正常DC组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组诱导的DC; 而VEGFA组与正常DC组无统计学意义(图3、 4)。图3 各组T细胞增殖率(%)的情况
3 讨论
DC是体内专职的抗原提呈细胞, 成熟DC具有较强的抗原提呈能力[8], 肿瘤患者外周血及免疫器官存在一定数量DC, 但肿瘤细胞仍能逃逸机体免疫监视而无限制生长, 这是由于肿瘤组织内的DC基本不成熟或不活跃, 其浸润数量与免疫反应的强弱并无必然相关性, 因此研究的重点转移到了肿瘤局部DC的功能和活性上[9]。
本结果显示, 早期未成熟DC, 在食管癌组织匀浆上清液模拟的肿瘤微环境影响下, 细胞形态方面明显落后于正常DC, 在基因水平也基本不表达CD1a, 并且膜表面低表达CD86、 CD11c等共刺
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