准品依次倍比稀释并设复孔, 每份癌及癌旁匀浆上清均设1复孔对照。应用SUNRISE酶标仪在波长450 nm条件下, 测各孔吸光度, 取平均吸光度为该样品的吸光度(A)值。根据VEGFA标准品浓度与吸光度的线性回归关系, 绘制出标准曲线, 由A值计算出每份匀浆上清中VEGFA的浓度。
1.2.3 食管癌EC9706全细胞抗原的制备 常规培养并收集EC9706细胞, PBS洗2遍, 调密度为1×1010/L的细胞悬液, 置入EP管中, 超声破碎法制备抗原: 时间3 min, 脉冲4 s, 振幅1。13 000 r/min, 30 min, 4℃离心收集上清液, 过滤, 按照Bradford蛋白质定量法制作标准曲线, 测定抗原浓度。-20℃冻存备用。
1.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离及DC的诱导 方法参照文献[7], 稍作修改: 抽取健康成人新鲜外周血50 mL、 肝素抗凝、 生理盐水稀释后, 与淋巴细胞分离液以2∶1的比例缓慢加入离心管, 1 500 r/min, 25 min离心后, 毛细吸管轻轻吸取白膜层, 生理盐水洗涤3次(1 300 r/min, 8 min), 获得人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)。以含100 mL/L自体血清RPMI1640调密度为2×109/L种于24孔板, 37℃贴壁3 h, 收集悬浮细胞, 尼龙毛柱法纯化后获得T淋巴细胞, 种于50 mL培养瓶中, 含rhIL2因子的RPMI1640培养基培养, 备用。去除悬浮细胞后的贴壁细胞用含rhGMCSF 100 μg/L, rhIL4 5 μg/L及100 mL/L自体血清RPMI1640培养液诱导培养DC。第2天实验组在上述诱导DC的基础上分组分别添加食管癌匀浆上清200 mL/L、 癌旁匀浆上清200 mL/L、 VEGFA 10 μg/L。隔天半量换液。第4天各组加入EC9706抗原, 第6天加入脂多糖5 μg/L, 第8天收集细胞, 进行形态观察, 免疫表型分析, RTPCR以及混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)和体外杀伤反应。
1.2.5 FCM检测细胞免疫学表型 分别于培养0 d (PBMC贴壁3 h去除悬浮细胞后)、 8 d, 收集细胞PBS洗2遍。10 g/L多聚甲醛固定5 min, PBS洗1遍。用PBS调细胞密度为1×109/L, 按20 μL/106个细胞加入荧光标记的mAb(0 d细胞检测CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR; 8 d细胞检测CD86、 CD11c及CD1a)4℃冰箱避光孵育30 min后加入PBS 1 mL, 吹打均匀, 1 000 r/min, 离心5 min, 弃去未结合的多余抗体。每管加入1 mL PBS重悬, 2 h内上机检测。
1.2.6 RTPCR 各诱导组细胞总mRNA的提取: 弃掉培养液, 用PBS洗2遍, 在24孔板里加入TRIzol 1 mL, 吹打均匀(呈黏稠状), 室温静置5 min。转入无RNA酶的EP管中, 加225 μL氯仿, 盖帽, 剧烈振荡15~30 s, 室温静置3 min, 4℃, 14 000 r/min, 离心15 min。吸取上清移至新EP管, 加异丙醇0.5 mL, 充分混匀, 4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。弃上清, 加DEPC水配制750 mL/L乙醇1 mL, 振荡洗涤沉淀, 4℃, 7 500 r/min, 离心5 min。得到mRNA, 按照一步法RTPCR试剂盒说明书操作, 获得目的基因DNA片段。CD1a引物: (5′primer): 5′GCTGCACTCTGGAAAGGTCT3′(3′primer): 5′CCAAAGCGCAAGACCTATCA3′(扩增片段长度为601 bp); GAPDH基因作为内参照(5′primer): 5′AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3′, (3′primer): 5′CTTGACAAAGTGGTCGTTGAGG3′(扩增片段长度为915 bp)。
1.2.7 CCK8检测致敏DC诱导MLR及特异性CTL对EC9706细胞杀伤效应 (1)致敏DC的获取: DC培养第4天, 各组加入终浓度为100 mg/L EC9706细胞抗原, 第8天收集DC, 即为负载EC9706抗原的DC。(2)MLR: 各组负载EC9706抗原的致敏DC为刺激细胞, 同种自体T细胞为反应细胞, 两者按1∶20比例混合, 以1×10
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