脂肪源性干细胞体外成骨特性的研究

　　从图4可以看出，所培养的细胞经过1～3 d的潜伏期，进入对数生长期，在第7天到达高峰而进入平台期。与P3相比，P5、P7、P9细胞增殖未见明显减缓。细胞由P0传代至P9，每代倍增基本保持稳定，未发现有下降趋势，说明ADSCs经长期传代，细胞仍能保持良好的增殖能力。

　　2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测

　　免疫荧光检测结果见培养细胞为CD44阳性，表明这种细胞为间充质干细胞;而CD45为阴性表达，证明所检测细胞并非来自于血液循环中的干细胞(见图5)。

　　2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、VonKossa染色鉴定

　　成骨诱导后3 d细胞无明显变化，诱导4 d后可观察到少许细胞逐渐由梭形变为立方形、多角形，体积增大;诱导8 d后，多数细胞转变为多角形，有数个突起，细胞持续增殖、重叠，逐渐聚集形成多个散在的细胞结节。14 d后可见细胞结节中央区形成矿化结节;诱导21 d后，可见矿化结节较诱导14 d时明显增大，数量明显增多。碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色结果：成骨诱导2周时可见有红棕色或咖啡色、深咖啡色颗粒充满胞浆(见图6)。

　　Von Kossa染色结果：成骨诱导2周和3周时用VonKossa方法检测钙盐的沉积，染色的阳性结果为棕黑色结节。镜下观察到成骨诱导2周时，形成的矿化结节较小，数量少(见图7);而诱导3周时，结节较大，数量增多(见图8)。对照组没有阳性染色表现。

　　2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定

　　成脂诱导分化3 d后，细胞中开始有小脂滴出现，主要集中于细胞核周围;诱导5 d时细胞内可见较明显脂滴;诱导10 d后细胞内布满大小不等的脂滴，小脂滴逐渐聚集成大的脂泡，细胞核被挤于细胞一侧，细胞逐渐增大;诱导12～14 d后细胞由原来的梭形变为圆形或多角形。油红O染色见脂滴被染成橘红色(见图9);对照组细胞未见阳性染色。

　　2.6 碱性磷酸酶浓度的测定

　　ALP浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别，在各个时间点诱导组ALP浓度均高于非诱导组(P<0.05，n=5)。诱导组ALP浓度在不同诱导时相其浓度变化趋势不同，诱导培养1周时，诱导组ALP浓度明显增加，2周时处于最高值，并且于3、4周时逐渐降低(P<0.05，n=5)，而对照组ALP浓度变化不大(见表1)。表1 ADSCs成骨诱导不同时间的ALP浓度(略)

　　2.7 钙离子浓度的测定

　　钙离子浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别，在各个时间点诱导组钙离子浓度高于非诱导组(P<0.05，n=5)。诱导组钙离子浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同。诱导培养1周时钙离子浓度稍增高，自第2周开始诱导组钙离子浓度逐渐增加，并且始终显著高于非诱导组，呈递增趋势并于4周时处于最高值(P<0.05，n=5)，而对照组钙离子浓度变化不大(见表2)。表2 ADSCs成骨诱导不同时间的钙离子浓度(略)

　　3 讨论

　　自20世纪90年代以来，以干细胞为基础的组织工程的发展已成为治疗各种组织缺损和退行性疾病的有效手段。作为组织工程最重要的的组成部分之一——种子细胞的获取、增殖和分化是组织工程研究的基础和前提。对骨组织工程而言，理想的骨种子细胞应具有以下特点[4]：a)取材容易，对机体损伤小;b)增殖能力强，体外培养易定向分化为成骨细胞，短时间体外培养即可获得足量成骨细胞;c)成骨能力强，适应受区环境能力强，植入人体后能很快形成新骨以替代支架材料;d)组织相容性好，能适应体内环境，保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等条件。ADSCs是近年来发现的一种新的成体干细胞。ADSCs体外培养时贴壁能力强，贴壁的细胞为梭形似成纤维细胞样形态，呈集落状、漩涡状生长，胞浆和核仁丰富。细胞周期分析显示，G0/G1期的细胞占69%，S期的细胞占24%，G2/M期的细胞占8%，提示ADSCs具有较强的再生能力[5]。ADSCs传至第10代时凋亡细胞率低于5%，15代时仅仅增加到15%，表明ADSCs体外扩增和自我更新能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。其次ADSCs的获得量也很大，平均300 mL脂肪组织可获得2×108～6×108个ADSCs，传至10～20代时，细胞的增殖速度无明显减慢[6]，而且脂肪组织中所含干细胞的数量不会随着患者年龄的增加而减少。另外，研究显示ADSCs能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞以及干细胞方向分化[7～8]。

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