EM重悬浮细胞，接种于25 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。24 h后更换培养液，以后每3天换液1次，并于倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞生长融合达80%～90%后，经0.25%胰酶消化，按1∶3进行传代培养。
1.2.2 rADSCs生长曲线的绘制
取10块96孔板，每块96孔板以5000/孔的密度将第3、5、7、9代细胞各接种于5个孔。此后每天同一时间，随机抽取一板，测定光密度值。测量时每孔加入噻唑蓝溶液(5 mg/mL)20 μL，继续在37℃、5%CO2培养箱中培养5 h后，吸弃孔内液体，每孔内加入150 μL DMSO，振荡20 min，在酶联免疫检测仪上选择492nm波长测定各孔OD值。以5孔OD值的均值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
1.2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测
取生长状态良好的第3代细胞爬片，参照文献[3]行免疫荧光检测细胞表面的抗原标记CD44和CD45。以PBS代替一抗作为阴性对照，镜下观察照相。
1.2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色鉴定
消化收集第3代ADSCs，以105/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中，待完全贴壁后换液为成骨诱导液(10%FBS的高糖DMEM中加入10-7mol/L地塞米松、L抗坏血酸50 μg/mL和10 mmol/Lβ甘油磷酸钠)进行成骨诱导。
碱性磷酸酶检测：诱导2周时终止培养，取出实验组和对照组细胞爬片按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行操作。
Von Kossa检测：成骨诱导2、3周时进行。将实验组和对照组细胞爬片用4%多聚甲醛固定，20 min后加入5%硝酸银避光孵育30 min，于紫外灯下照射1 h，苏木素复染核。
1.2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定
消化收集第3代ADSCs，以105个/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中，待完全贴壁后换液为成脂诱导液(10%FBS的高糖DMEM中加入10-6mol/L地塞米松、胰岛素10 mg/L、3异丁基1甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L)进行成脂诱导。
油红O染色：成脂诱导14 d后的实验组和对照组细胞爬片用甲醛钙固定液固定15 min，60%异丙醇媒染2 min，在油红O工作液内室温染色30 min，70%酒精分色。
1.2.6 碱性磷酸酶浓度检测
取第3代ADSCs细胞，以5×104个/孔接种于12孔板，加入普通培养液进行培养，待细胞完全铁壁后，将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导，剩余5孔培养条件不变，作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养，加入0.5 mL 0.1%聚乙二醇辛基苯基醚于4℃过夜，然后按照南京建成碱性磷酸酶测定试剂盒说明书进行操作。碱性磷酸酶浓度以金氏单位/100 mL表示。
1.2.7 钙离子浓度检测
用第3代ADSCs细胞，以5×104个/孔接种于12孔板，加入普通培养液进行培养，待细胞完全贴壁后，将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导，剩余5孔培养条件不变，作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养，加入0.6N HCL 0.5 mL于常温下过夜以将细胞外不溶性钙盐分解成可溶性钙离子，然后按照南京建成钙测定试剂盒说明书进行操作。钙离子浓度以mmol/L表示。
1.2.8 统计学处理
采用重复测量的方差分析对诱导组和非诱导组不同时间点的碱性磷酸酶和钙离子浓度进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ADSCs的体外培养
原代rADSCs培养4 h后，有少量短梭形或小多角形细胞散在贴壁，大部分未贴壁细胞为球形或圆形血细胞。第一次换液后，未贴壁细胞(大部分为红细胞)已去除，可见大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞，其间也可见少量三角形、多边形细胞(见图1)。随培养时间延长，这些贴壁细胞形态为典型的长梭形细胞，呈大小不一的集落状、漩涡状生长。培养5～6 d可达80%～90%致密层(见图2)，7～9 d可形成100%融合的致密单层。传代后细胞形态主要为长梭形，少数为三角形或多边形，呈漩涡状生长(见图3)，细胞生长速度较原代细胞明显增快，3～4 d可长满。连续传12代，细胞增殖未见明显减弱。
2.2 ADSCs生长曲线绘制
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