动荧光酶标仪在 490 nm波长下测定吸光度值 (D值)，取均值并绘制生长曲线。
1.2.5 免疫荧光染色 将盖片放入无水乙醇:冰醋酸=1∶1的液体中浸泡30 min;弃去浸泡液，纯水冲洗;再用无水乙醇浸泡30 min，然后用绸布擦干;将处理的盖片置于小平皿内高压、烤干备用。取P6代细胞，用0.25%胰酶37℃消化3 min左右，加入含10%FCS培养液中和胰酶，轻轻吹打细胞，吸取细胞悬液离心，800 r/min，6 min，使细胞形成微团，再用培养液重悬细胞;计数细胞，以104～105个细胞/ml接种在预先已放置盖片的24孔板内;当细胞长满盖片的80%左右，将培养液吸出，37℃预热的0.1 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;4%多聚甲醛室温固定30 min;0.1 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;蒸馏水冲洗3次，5 min/次;将细胞爬片在37℃孵箱中烘烤2 h，然后放入-20℃冰箱保存，以备染色。将爬片从24孔板内取出，蒸馏水水化10 min后，应用0.1%TritonX100渗透打孔10 min，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5min/次;滴加阻断剂室温孵育15 min;0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;滴加封闭血清，室温孵育30 min;甩掉盖片上的多余血清，滴加一抗(浓度为1∶50)，37℃孵育1 h或4℃过夜，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;滴加FITC标记二抗，同时加入罗丹明或DAPI染细胞核，放置于湿盒内，常温避光反应30 min，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，5 min/次;激光扫描共焦显微镜(LSCM)下观察。
1.2.6 成骨诱导体系的建立 将MG63、MG63M两个细胞系细胞，以3×103个细胞/cm2的密度接种于100 mm平皿内，加入含10%FBS的无酚红LDMEM培养基培养48 h后，换为成骨基础诱导液，分为MG63对照组、MG63M组;每4 d换1次培养液，雌激素和抑制剂每2 d添加1次，诱导24 d。行von cossa染色。
1.2.7 成脂肪诱导体系建立 将MG63、MG63M两种细胞系细胞，以4×103个细胞/cm2的密度接种于100 mm平皿内，加入含10%FBS的无酚红LDMEM培养基培养24 h后换为成脂肪诱导液(胰岛素0.01 mg/ml、0.2 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、0.2 μmol/L地塞米松，10%FBS无酚红LDMEM培养基)，每4 d换1次培养液，雌激素和抑制剂每2 d添加1次，诱导12 d。行油红O染色鉴定脂滴。
1.3 统计学处理 应用 SPSS11.5统计软件进行数据处理。计量资料采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 细胞球的形成 MG63骨肉瘤细胞离心后置于无血清培养基中，培养48～72 h后形成大小不等的只有数个细胞的圆形类细胞球，悬浮生长，而不能形成细胞球的贴壁细胞因无法耐药基本死亡。细胞球传代后 2 d即可见到次代肿瘤细胞球的形成，以后体积逐渐增大，形态规则。细胞球可传代，命名为“M”细胞株。见图1。
2.2 RTPCR结果 多能干细胞标志物(CD133)，胚胎干细胞标志物(OCT3/4、 nestin、nanog)，多药耐药基因(MDR1、ABCG2)均在“M”细胞中呈现高表达。
2.3 流式细胞仪测定细胞表面标志物 流式细胞仪检测间充质干细胞标志物(CD105，CD90，CD44，CD29)，造血干细胞标志物(CD34，CD133)，上皮干细胞标志物(CD24)。结果证明CD34、CD31、CD105无论在MG63还是M细胞株都呈阴性表达，而CD90和CD44都呈较强的阳性，且表达量基本相当。而M细胞株CD29表达量略高，CD24略低于MG63;多能干细胞标志物CD133在M细胞中的表达远远高于MG63，而这在RTPCR 的检测中也得到了验证。
2.4 类肿瘤干细胞增殖活性 类肿瘤干细胞的增殖潜伏期约为 22.8 h,传代后 24～48 h即可见传代的肿瘤干细胞形成，以后细胞数量逐渐增多。类肿瘤干细胞对数倍增时间约为传代后3～5 d。
2.5 免疫荧光染色 无血清悬浮培养中的悬浮肉瘤细胞球行免疫荧光染色，发现多能干细胞标志物(CD133)、胚胎干细胞标志物(OCT3/4、 nestin、nanog)、多药耐药基因(MDR1、ABCG2)均呈阳性表达。PI染细胞核。见图2。
2.6 成骨、成脂肪诱
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