SDF 1 CXCR4促进骨髓基质细胞迁移的作用

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　SDF-1(R&D，英国)，CXCR4阻断型Ab(R&D公司)。DMEM培养液(Gibco，BOSTER )，胎牛血清(BOSTER)，3月龄雄性SD大鼠，兔抗鼠多克隆抗体CD34，CD44，CD45，CD54、CXCR4(BOSTER)，免疫组化(SP)试剂盒(BOSTER公司)。倒置像差显微镜(OLympas CK40)，CO2培养箱(Toua3法国)，自动酶标检测仪(BioRad 550，美国)，Transwell-clear48孔板(Costar，美国)，孔径8 μm。CO2培养箱(Heraeus)，超净工作台(Nuair)，低速离心机(Heraeus)，胰蛋白酶(Sigma)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 骨髓基质细胞分离和培养

　　大鼠颈椎脱臼处死后，取其双侧股骨和胫骨。在超净台内剪断上下干骺端，用含10%胎牛血清的DMEM注射器插入骨髓腔冲洗，将骨髓细胞冲入培养皿中，用DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，然后加入适量的DMEM(含10%胎牛血清)，置37 ℃，5% CO2培养箱培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。2天后换液，以去除未贴壁的血细胞，以后每隔3天换液1次。培养细胞铺满后用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。免疫组织化学方法对MSCs进行鉴定

　　1.2.2 免疫组织化学方法检测MSCs中CXCR4表达

　　Poly-Lysine玻片防脱片剂处理，取2-10代MSCs细胞制成细胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，30%H2O2 1份+蒸馏水10 份混合，室温5～10 分钟。蒸馏水洗3次。滴加5%BSA封闭液，室温20 分钟。甩去多余液体。滴加稀释的一抗(CD34∶1∶200、CD44∶1∶200、CD54∶1∶200、CXCR4∶1∶100)，37 ℃ 1 小时。PBS洗2 分钟×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃20 分钟。PBS洗 2分钟×3 次。滴加试剂SABC，37 ℃20分钟。PBS洗5 分钟×4 次。使用DAB显色试剂盒(AR1022)显色。蒸馏水洗涤。脱水，透明，封片。同样方法对神经胶质细胞中CXCR4检测进行对照。显微镜观察，MSCs细胞表面CXCR4的检测：以细胞胞浆中显示棕黄色颗粒定为阳性反应。每张涂片计数100个细胞;依细胞的反应强度计分(0～4 分)，计算细胞的平均反应强度的积分值(%)。

　　1.2.3 微孔隔离室穿越实验

　　每六孔为一组，transwell经无血清的DMEM培液于培养箱中平衡1 小时;消化细胞(2代)，无血清培养基洗2 次，计数，配成(1×106/mL)细胞悬液，上室每孔加入 100 μL 细胞悬液;Transwell板下室分别置、含不同浓度的重组人SDF-1(0、50、100、150、200、250、300 ng/mL)的无血清的DMEM，另取一组上、下室同时加入100 ng/mLSDF-1，置于5% CO2，37 ℃饱和湿度培养箱培养24 h;用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2 遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。

　　1.2.4 阻断试验

　　将CXCR4阻断型抗体20 g/mL和20%FBS的 DMEM空白对照分别与1×106/mL BMSCs作用20 min后，加入上室;BMSCs培养上清液、含100 ng/mL SDF-l的DMEM及DMEM空白对照置于transwell板下室， 37 ℃饱和湿度培养箱温育24 h，用棉球擦去上表面细胞，PBS洗2遍，5%戊二醛固定，显微镜下观察计数。

　　1.2.5 统计方法

　　计数穿过微孔及黏附于膜下表面的细胞，随机取5个视野(光镜200×)的细胞数。数据使用均值±标准差表示。应用EXCELL2003统计软件对实验数据进行方差分析及q检验。

　　2 结 果

　　2.1 CXCR4抗原表达

　　原代培养骨髓基质细胞约24～48 h贴壁，细胞初为淋巴细胞样小圆细胞。约7～l0 d可铺满培养皿，细胞融合成单层。此时细胞为多角形、三角形或梭形，呈集落状生长。传代培养原代细胞逐渐伸展为梭形、三角形、多角形，胞体较原代略膨大，有胞浆突起，成旋涡或平行状排列。5～7 d即可长满。MSCs鉴定： MSCs免疫组化显示CD34、CD45表达阴性，CD44、CD54表达阳性，第5代MSCs特异性表面标志物CD44， CD54表达率分别是99.5% ，98.1%(图1)。

　　免疫组化显示MSCs有

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