SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

　　2.4 甲苯胺蓝染色 取C1和C4细胞爬片行甲苯胺蓝染色对比，可见C1蓝染细胞达到98%之多，而且颜色较深。而C4细胞可见少量细胞显色，但较C1细胞浅很多，而且细胞形态也较小(图4A、4B)。表1 软骨细胞生长曲线

　　2.5 II型胶原免疫组织化学染色 C1细胞在II型胶原免疫组织化学染色后，荧光显微镜下观察可见细胞发出较强的绿色荧光，而且分布均匀，和C4细胞做对比，则C4细胞的荧光强度明显降低，而且细胞形态也呈梭形(图5A、5B)。

　　3 讨 论

　　软骨细胞外基质由胶原和蛋白聚糖组成，其中胶原占软骨干重的50%～70%，蛋白聚糖占20%～40%，结构糖蛋白占5%～15%。胶原主要由II型组成，其他还含有，它们形成一个网络结构，使软骨具有特殊的应力和形态，对杭高度亲水的蛋白聚糖产生的肿胀压。本实验采用胰蛋白酶和II型胶原酶两步消化法。先采用胰蛋白酶的主要作用是使细胞间质的蛋白质水解，但不宜浓度太大和时间太长，否则也会损伤细胞。II型胶原酶的主要目的则是分解开细胞间II型胶原产生的应力，但由于少量的V型、VI型、IX型、X型和XI型胶原的存在，不能完全用酶将细胞分离开，所以后期需要频繁地进行吹打，其目的是为了使细胞充分地离散。使用该方法获得的细胞行台盼蓝染色后显示，其分离出来的软骨细胞活性达到97%，完全可以作为实验细胞使用。

　　软骨细胞具有高分化特性，但普通单层贴壁培养的软骨细胞在体外其表型难以维持，软骨细胞将会发生一系列的变化:包括形态、表型及相关基因的表达，这过程一般被称为软骨细胞的去分化(Dedifferentiation)现象[3]。

　　本实验在软骨细胞的通过软骨细胞单层培养过程中观察到，在传代过程中细胞的形态逐渐发生了变化，原代的软骨细胞贴壁后在倒置显微镜下细胞多呈多角形、星形、圆形，胞质颜色较深，胞核为圆形，细胞饱满而大。传代至第四代倒置显微镜下观察发现细胞开始呈现不规则形，多数形态表现为近似于细长梭形。第五代梭形变的细胞达到80%。从细胞的形态特征看，软骨细胞梭形变是判断软骨细胞表型是否改变的主要指标[4]。

　　试验中也同时从细胞的功能上对软骨细胞传代前后进行了分析，主要通过蛋白多糖和II型胶原的检测来观察。原代软骨细胞的甲苯胺蓝染色呈强阳性，且分布均匀，而相同处理后的第四代软骨细胞则出现阴性结果，虽然部分细胞继续有阳性表达，但也是较弱的表达。从而说明传代次数可以使软骨细胞的蛋白多糖分泌明显减少，四代以后尤为明显。II型胶原是软骨的主要胶原，主要由软骨细胞分泌，本实验通过软骨细胞II型胶原的免疫组织化学检测对原代及传代细胞进行了分析，C1细胞荧光显微镜下发出较强的绿色荧光，呈强阳性; C4也可见部分细胞出现绿色荧光，但很弱，且细胞形态多呈不规则形。说明C1细胞的II型胶原分泌较旺盛，而传至第四代的软骨细胞II型胶原分泌明显减少。由于失去了细胞外基质对软骨细胞的作用，经多次传代，软骨细胞即从多角形演变为成纤维细胞样的外观。细胞外基质逐渐减少，胶原的类型发生改变，最终导致软骨细胞的特有表型丧失[5-8]。从分子水平上细胞内II型胶原、蛋白多糖的mRNA减少;从细胞功能上，细胞合成和分泌的II型胶原、蛋白多糖在减少，而I型胶原在增加，都可以说明软骨细胞己具有成纤维细胞的特征，而不具有或较少具有软骨细胞特征[9]。

　　Meyer和Chatterjee[10]于1978年提出了软骨移植成功的4个条件:(1)软骨细胞保持生存;(2)保持活力并持续产生胶原和蛋白多糖;(3)骨软骨片与宿主骨牢固连接;(4)能抵抗宿主的免疫作用。至今仍适用。本人通过实验认为软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞修复软骨缺损，但要想使软骨细胞在体外更长时间地保持其某些特性，则需要模拟软骨的体内环境进行培养。因为软骨细胞正是在单层培养失分化过程中获得增殖能力[11]，所以在需要大量的软骨细胞进行移植的话，通过软骨细胞的体外扩增是不可取的，这样就需要更容易获得并扩增的其它种子细胞进行诱导移植。

　　【参考文献】

　　[1] Webber RJ, York JL, Vanderschilden JL, et al. An organ culture model for assaying wound repair of the fibrocartilaginous knee joint meniscus[J]

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