SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察

　　本实验拟为软骨种子工程种子软骨细胞的优化获取提供一种有效的可行方法，并探讨其分化能力及分化后的生物学性状。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 II型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，标准胎牛血清(Gibco公司)，高糖DMEM培基(Gibco公司);青霉素及链霉素(新华制药公司)CO2恒温培养箱(HERA Cell);兔抗鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(mAb)、PV两步法免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物有限公司)。

　　1.2 软骨细胞的采集 选用新生3～5 天的SD大鼠乳鼠1 只，浸入75%的医用酒精中，5 min×3 次，处死并消毒;无菌条件下取大鼠肋软骨，用PBS(含青、链霉素各100 U/mL)冲洗2 次，剔除软骨表面肌肉、骨膜及纤维组织，将软骨用眼科剪至1 mm×1 mm的碎块，加入3倍体积的0.25%的胰酶37℃消化半小时，中间吹打1 次，弃掉胰酶后加入同胰酶相同体积的DMEM(含15%胎牛血清)终止消化，然后800 r/min离心5 min，弃上清加2倍体积的0.1%II型胶原酶消化4 h，前3小时间每一小时晃动培养皿1 次，观察大部分软骨块消化后，15 min吹打1 次，提取消化细胞悬液镜下观察细胞量足够多后经200目金属筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，去上清，再用培养基洗2 次，用加入5 mL完全培养基(含15%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL)重新悬浮细胞，将细胞接种于25 mL的培养瓶中培养，标记为C1，留取部分悬液行台盼蓝染色计数并检测活细胞比例。

　　1.3 软骨细胞单层培养及生物学特性动态观察

　　按2×104 细胞/cm2 的密度接种, 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，24 h 后更换培养液(含10%小牛血清), 以后培养基每2 d更换1 次。当软骨细胞达到85%融合后以0.25%胰蛋白酶消化传代。再次接种密度仍为2×104 细胞/cm2,传代培养条件与原代培养相同，并依次标记为C2……C6。倒置显微镜下观察每一代细胞的生长、形态变化、细胞活力、分化融合的生物学特性形态并拍照记录。取生长状态良好的原代细胞进行生长状态观察，用0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个/孔接种于24 孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共8日根据记数结果绘制细胞生长曲线。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，描绘在坐标纸上，得到生长曲线。

　　1.4 甲苯胺蓝染色 将0.5 g甲苯胺蓝溶于100 mL PBS中配成0.5%甲苯胺蓝溶液，将爬满软骨细胞的玻片用10%福尔马林固定1 h，自来水冲洗15 min，蒸馏水冲洗1次，甲苯胺蓝染色2～4 h，75%乙醇冲洗1 次，90%乙醇冲洗1次，95%乙醇冲洗1 次，光镜下观察照相。

　　1.5 II型胶原免疫组织化学染色 将原代软骨细胞接种于6孔板中的盖玻片， 95%乙醇固定15 min，PBS洗涤，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2 次;加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加兔抗鼠一抗(1:100)，37 ℃孵育2 h;PBS洗5 min，3 次;行SABC免疫细胞化学染色。直接参照SABC试剂盒操作方法进行显色。

　　2 结 果

　　2.1 新生SD大鼠肋软骨原代细胞培养和形态学观察 刚接种的原代软骨细胞倒置显微镜下观察大多成圆球形悬浮于培养液中;接种8 h 后大多数细胞呈圆形贴壁状态并开始展开(图1A);24 h 后细胞扁平且透亮，边缘出现突起，可见伪足伸出，细胞形态为多角形、星形、圆形，胞质颜色较深，胞核为圆形。细胞在培养3天以后增值迅速，6 d 以后细胞铺满瓶底, 呈“铺路石”状, 同时还有相当多保持圆形的细胞(图1B)，部分地方出现分层生长 。细胞达到80%融合，必须进行传代。各代细胞胎盘蓝染色测定细胞活力均达到97%以上。

　　2.2 软骨细胞传代培养和形态学观察 传代后的软骨细胞贴壁较快，刚传代的细胞为圆形，折光性好，接种后一般在2～4 h细胞迅速贴壁、伸展，漂浮的细胞较原代培养明显减少，3～4天细胞即可铺满瓶底。随着传代次数的增加，软骨细胞明显梭形变，C3可见部分细胞呈三角形(图2A)，含少量的梭形细胞，传代到C4，明显的不规则形细胞增多，C6可见细胞基本呈不规则形(图2B)。

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