骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

　　所得数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计软件做统计分析，组间比较采用重复测量方差分析，P<0.05表示差异具有显著性意义。

　　2 结果

　　2.1 骨髓基质细胞培养

　　原代培养24 h后，可见少量细胞贴壁生长，形态为圆形，72 h左右，细胞开始增值并形成细胞集落，细胞常围绕集落中央呈岛状向四周分布，细胞形态多样，多为扁平多角形、三角形或梭形，7～14 d细胞达到90%融合形成单层细胞层。传代后，细胞增值速度加快，3～5 d即可长满培养瓶底，随着传代代数的增加，细胞形态多较均一为长梭形，并呈漩涡或平行状排列生长(图1)。

　　2.2 TUNEL原位末端标记检测结果

　　正常对照组脊髓组织偶见零星TUNEL阳性细胞。脊髓损伤后，DMEM组和BMSCs组阳性细胞数量均明显增加，于术后3 d阳性细胞数最多达高峰，其后随时间延长逐渐减少。阳性细胞分布于脊髓灰质和白质内，但以白质内神经细胞为主。术后3、7和14 d，BMSCs组TUNEL阳性细胞的数目明显少于DMEM组(表1、图2、3)。

　　表1 各组大鼠术后不同时间点损伤周围区脊髓内神经细胞的凋亡指数(略)

　　与正常对照组比较，#P<0.05;##P<0.01，与DMEM处理组比较，*P<0.05

　　3 讨论

　　干细胞作为移植物治疗脊髓损伤显示出独特的希望，因为他们可以做为支持轴突再生的桥梁并且可以分化成神经元或神经胶质细胞，从而替代损伤的内源性神经细胞。而存在于成体骨髓内的多潜能成体干细胞在体外培养过程中给予适当的处理能够产生神经胶质样和神经元样细胞，并且在体内能够分化成神经胶质细胞样，少突胶质细胞样细胞，同时一些细胞能够表达未成熟神经元标志物[3]。脊髓损伤是一破坏性的神经系统损伤，由于脊髓神经元和轴突的丧失而导致功能缺陷。近年来，许多注意力集中于继发性损伤，因为继发性损伤表现出对治疗干预更敏感。原发性脊髓损伤后出现一系列神经毒性事件称为继发性损伤，其包括：局部炎症反应和细胞凋亡。细胞凋亡是急性脊髓损伤后神经细胞的主要死亡形式，也是加重脊髓损伤的一个重要因素。早期为神经元出现凋亡，接下来主要是退变的白质传导束中的少突胶质细胞发生延迟的凋亡。

　　当前脊髓损伤研究大多集中在利用BMSCs的再生潜能，通过替代损伤的神经元和少突胶质细胞以获得功能恢复。但是研究显示只有很小比例的BMSCs分化为神经实质细胞表型。有的研究者还发现，BMSCs移植后促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复，但并没有检测到BMSCs向神经细胞分化[4]。因此，认为BMSCs移植促进脊髓损伤后神经功能改善不能完全用替代死亡和损伤的神经细胞来解释，其他的作用机制可能参与SCI的修复。

　　本研究结果显示，脊髓损伤后，损伤区周围脊髓灰质和白质中的凋亡细胞数量明显增加，这提示脊髓损伤后，损伤周围存在大量的神经细胞凋亡，凋亡所导致的神经细胞死亡是扩大脊髓损伤范围的一个因素。同时，还发现脊髓损伤3天后，凋亡细胞以白质内神经细胞为主，而白质内存在的主要神经细胞为形成髓鞘的少突胶质细胞，这说明凋亡在脊髓损伤中、远期慢性脱髓鞘过程中起着重要作用。在本研究，BMSCs组凋亡的神经细胞数目明显少于DMEM组，这提示脊髓损伤后局部移植BMSCs能够抑制损伤周围组织内神经细胞的凋亡。这一发现与Venkata 等人的研究结果相一致[5]。我们推测BMSCs抑制神经细胞凋亡的可能机制包括：(1)BMSCs通过产生直接对神经细胞具有营养和保护作用的细胞因子和营养因子，保护损伤脊髓组织内的神经细胞免受或逆转脊髓继发损伤所导致的伤害。因为，以往研究表明BMSCs能够刺激受体组织分泌及自身分泌一系列具有保护和营养神经细胞作用的生长因子和营养因子[6-8]，例如：脑源性神经营养因子(BDNF),神经生长因子(NGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。此外，我们前期实验亦证实，脊髓损伤后移植BMSCs能够上调损伤脊髓组织内VEGF表达[1]4116。而体外和体内试验证实，应用外源性VEGF能够抑制神经细胞的凋亡[9]。(2)BMSCs在损伤的脊髓组织中下调诱导细胞凋亡的细胞因子。以往试验表明应用外源性VEGF或BMSCs移植能够显著下调脊髓损伤后神经元和少突胶质细胞表达诱导细胞凋亡的Caspase-3[5]2080-2093。而Caspase-3是凋亡过程中最重要的半胱氨酸蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。因此，我们推测，BMSCs修复脊髓损伤的机制之一可能是通过上调损伤脊髓内VEGF

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