骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

　　骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)在修复神经退变性疾病和创伤性损伤方面的潜力已成为研究的热点。近年来，国内外大量文献报道，BMSCs移植可明显改善脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)后的神经功能，但BMSCs治疗脊髓损伤的作用机制仍然不清。我们的前期实验发现BMSCs移植能够上调损伤脊髓组织内血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体胎肝激酶-1( Fetal liver kinase-1，Flk-1)的表达[1,2]，而VEGF与Flk-1结合所介导VEGF的一个重要生物学作用是促进神经保护。故本研究拟利用TUNEL方法，验证BMSCs是否能够下调损伤脊髓组织内的神经细胞凋亡，探讨BMSCs移植治疗脊髓损伤的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和试剂

　　Wistar雌性大鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)。低糖DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司，美国)。细胞凋亡检测试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。

　　1.2 骨髓基质细胞培养

　　取4 周大小Wistar大鼠(体重120 g左右)，断头处死后立即无菌条件下取双侧股骨和胫骨，用PBS(phosphate-buffer saline solution;0.1 M;pH 7.4)清洗干净。用剪刀除去股骨和胫骨两端，暴露骨髓腔。用无菌5 mL注射器从骨的一端反复注入DMEM培养液冲洗骨髓腔，在另一端收集。将收集的骨髓反复抽吸吹打，制成单细胞悬液。收集细胞悬液，800×g离心5 min去除碎片，然后用含10%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮沉淀的细胞。吹散后调整骨髓细胞密度，将细胞稀释后按2.5×105个/cm3密度接种塑料培养瓶，置37 ℃，湿度95%和5%CO2培养箱中培养。24 h后通过首次全量换液去除未贴壁的细胞，以后每隔2～3天换液1 次，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。当细胞达到80%～90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后轻柔吹打使之成为单细胞悬液，然后按1∶3传代扩增。细胞传3～4代，移植前用无血清DMEM洗涤细胞3 次，500×g离心后重悬于无血清DMEM中，0.3%胎盘蓝检测细胞活力，调整细胞终密度2.5×104个/μL存于冰上备用。

　　1.3 脊髓损伤模型制作和实验动物分组

　　Wistar大鼠，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，参照Taoka′s脊髓压迫损伤模型制作方法，略加改动。动物俯卧固定,背部剪毛后，常规消毒后铺无菌孔巾，以T9棘突为中心取背部后正中切口，长约3 cm，依次切开皮肤、皮下组织，显露T8～T10棘突及椎板。轻轻咬除T9节段棘突和两侧椎板，打开椎管至椎弓根部，暴露脊髓约8 mm。以T9相对区域为损伤区，后正中血管为中心，使用重30 g,接触面积4 mm2重物垂直压迫脊髓10 min。实验动物随机分为3 组：(1)正常对照组(n =6只)：未行任何处置;(2)DMEM组(n =18只)：脊髓损伤区周围注射DMEM;(3)BMSCs组(n =18只)：脊髓损伤区周围注射BMSCs。

　　1.4 骨髓基质细胞移植

　　损伤30 min后，通过立体定位仪，用微量注射器接无菌玻璃拉丝针头将BMSCs悬液缓慢注入到距脊髓损伤区头、尾侧各1.0 mm，距中线0.5 mm脊髓实质内。注射深度分别是1.75、1.25、0.75 mm。每点3 μL(75 000个细胞)，每只动物移植的细胞总数共3.0×105个细胞，注射时间5～10 min，为防止细胞倒流留针5 min。依同样方法DMEM组注射等量DMEM培养液。术后每日2 次膀胱按摩排尿，1 周内每日腹腔注射抗生素。

　　1.5 TUNEL原位末端标记

　　3 组试验动物分别在术后3、7和14 d取材，正常对照组每次取材2 只，其余两组每次取材6 只。麻醉下经左心室灌注生理盐水后用4%冷多聚甲醛灌流固定，完整取出以T为中心的脊髓节段(长约1.5 mm)。多聚甲醛后固定过夜后，石蜡包埋。对距离损伤区头、尾侧各1～2 mm的脊髓组织切片后进行细胞凋亡检测，按细胞凋亡检测试剂盒说明书程序操作。阳性对照：在标记反应前用DNA酶消化;阴性对照：标记反应液省去末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)。光镜下观察，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。在高倍光镜下,计算凋亡指数，即每张切片选取5个阳性细胞数最多的高倍视野，计算出平均阳性细胞百分数。

　　1.6

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