氨基胍对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

　　KEY WORDS: aminoguanidine; osteoarthritis; chondrocyte; apoptosis; rabbit; iNOS

　　骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种老年常见慢性疾病，严重影响患者的生活质量，其重要的病理学特征是关节软骨的降解(包括软骨细胞的数量减少和细胞外基质降解)。早期缺乏有效的特异性治疗方法，往往因症状加重而需行人工关节置换术。现研究证明，OA患者体内一氧化氮(nitric oxide, NO)浓度升高。过高的NO可影响关节软骨的代谢，造成软骨细胞凋亡增多。氨基胍(aminoguanidine, AG)是一种选择性的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)抑制剂，本实验使用AG干预兔OA模型，观察关节软骨的形态变化及软骨细胞凋亡，旨在探讨治疗OA的新途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康成熟日本大耳白兔32只，体重2.2-2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。氨基胍硫酸盐由美国Sigma公司购得，iNOS免疫组化染色一抗购自博士德生物工程有限公司，二抗及碱性磷酸酶购自北京鼎国生物技术公司，原位细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)购自美国罗氏公司。

　　1.2 实验分组 32只兔子随机分为正常组、模型组和氨基胍组。后两组行右后肢伸直位管型石膏固定造模,自由活动，正常喂养。氨基胍组腹腔内注射氨基胍硫酸盐溶液100mg/(kg·d)，模型组每天腹腔内注射相同体积的生理盐水，正常组不予任何处理。密切观察动物，有石膏松动迹象时，予以修复，牢靠固定。

　　1.3 形态观察及HE染色 4、8周时采用空气栓塞法分别处死各组半数动物，取右后肢股骨髁进行大体标本病理学观察后，用40g/L多聚甲醛固定，100g/L EDTA脱钙液脱钙，制备切片，HE染色。

　　1.4 TUNEL法检测细胞凋亡 切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢处理10min，用蛋白酶K于37℃消化15min，滴加25μL的TUNEL反应混合溶液(含末端脱氧核糖核酸转移酶TDT及含有核苷酸混合液)，在湿盒中37℃孵育60min，DAB显色，苏木素复染，封片。阳性对照：在切片置TUNEL反应混合溶液前，先在200ng/mL DNaseⅠ(DNA聚合酶Ⅰ)溶液中37℃下反应15min;阴性对照标记时不加TDT，其余步骤相同。

　　1.5 iNOS的免疫组化染色 切片二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，30mL/L过氧化氢甲醇冲洗，磷酸盐缓冲液冲洗，1.25g/L胰蛋白酶消化。加入10mL/L牛血清白蛋白，20℃孵育15min。第一抗体在4℃下孵育18h，第二抗体孵育30min。加标记液(碱性磷酸酶)反应30min，加显色液反应30min，细胞核用苏木素复染。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。

　　1.6 切片观察及统计学处理 光学显微镜10×10倍视野下，于软骨细胞层中随机选取4个视野，分别统计100个细胞内平均iNOS表达阳性细胞数和凋亡阳性细胞数。应用SPSS10.0统计软件，采用方差分析及t检验，检验水准为α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 大体标本观察 正常组关节软骨呈浅蓝白色，半透明，表面光滑，边缘规整，无缺损及裂隙，有弹性，光泽度好，4周和8周无差异。氨基胍组4周时软骨表面呈蓝白色，颜色较深，表面光滑，有光泽，未见缺损及裂隙;8周时软骨表面呈蓝白色，基本光滑，有光泽，未见缺损及裂隙。模型组4周时软骨表面呈淡黄白色，透明度差，表面不光滑、粗糙，可见软骨面的缺损;8周时软骨表面呈黄白色，色泽暗淡，表面粗糙，缺乏弹性，部分标本有较大的缺损和裂隙。

　　2.2 光学显微镜观察 正常组软骨表面光滑，细胞排列规整，层次清楚，细胞无增生肥大，基质染色均匀，未见血管分布。氨基胍组4周时软骨表面光滑，无裂隙，软骨细胞增生、肥大，排列尚好，基质染色基本均匀，未见血管翳生成;8周时软骨表面尚光滑，软骨细胞增生、肥大，层次增厚，排列紊乱，有细胞簇聚现象，深层有血管增生，潮线模糊。模型组4周时软骨表面不光滑，存在局部小凹陷，软骨细胞增生、大小不等，有簇聚现象，排列

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