不同时相点切片，应用ImagePro Plus Version 5.1 for Window TM 图像分析系统(Media Cybernetics，Inc，USA)进行图像分析，测定阳性细胞平均积分吸光度(integrated optical density, IOD)。
1.7 统计学处理 采用SPSS 12.0 for Windows统计软件。所有数据以±s表示，计量资料采用方差分析，组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 后肢运动功能的观察 假手术组兔术后1-7d无明显瘫痪表现，截瘫率为0; 缺血再灌注8h组所有白兔未发生瘫痪;缺血再灌注24h组、72h组和168h组所有白兔出现延迟性瘫痪，截瘫发生在16-24h，平均19.6h，截瘫率为100%(18/18)。所有出现瘫痪的动物，神经功能评分未见明显改善(图1)。
图1 再灌注168h各组白兔后肢运动功能的评分(略)
Fig.1 Motor deficit score in the ischemia reperfusion groups and in the sham group during 168h
2.2 脊髓组织HE染色的病理学观察 对照组：神经细胞轮廓清晰，胞浆均匀深染，整个组织结构完整、清楚，无中性粒细胞浸润，无出血、水肿(图2A)。缺血再灌注组：再灌注8h组见神经细胞形态基本正常，结构清楚，灰质中有少量空泡，但神经元细胞结构完好(图2B);再灌注24h组：灰质中前角神经元细胞破坏严重，空泡形成，无明显炎症细胞浸润(图2C);再灌注72h组：灰质前角中大量空泡形成，尚残存数个结构清楚的运动神经元细胞，有明显炎症细胞浸润(图2D);再灌注168h组：灰质中运动神经元消失，残存数个固缩坏死神经元，周围有明显炎症反应(图2E)。
图2 脊髓缺血再灌注后不同时间的病理变化(略)
Fig.2 Motor neurons in anterior horn of spinal cord in normal controls (A) and of reperfusion group at 8h (B), 24h (C), 72h (D), 168h (E) after ischemia (HE×100)
2.3 TUNEL的观察 对照组：组织切片标记后清晰显示出脊髓组织的正常结构，灰质和白质易区分，神经元和胶质细胞均蓝染，棕黄色的阳性细胞罕见(图3A)。再灌注8h后，仅见非特异性染色(图3B);再灌注24h后出现大量阳性细胞(图3C)，至再灌注72h达到最高峰，主要分布在前角运动神经元(图3D)。再灌注1周后，灰质结构破坏严重，仅有少量神经元幸存，但白质中阳性胶质细胞数量增加(图3E)。IOD显示，再灌注组与对照组比较，除再灌注8h无差异外，其余均比对照组高(表1)。
图3 脊髓缺血再灌注后不同时间的神经细胞凋亡(略)
Fig.3 Positive neurons in anterior horn of spinal cord with TUNEL staining in sham group (A) and of reperfusion group at 8h (B), 24h (C), 72h (D), 168h (E) after ischemia (TUNEL×400)
表1 各组不同再灌注时间的积分吸光度(略)
Table 1 IOD values of TUNEL staining changes in the anterior horn of spinal cord
*P<0.05, **P<0.01 vs. sham groups
3 讨论
凋亡的概念是1972年由Kerr等人提出的，它是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己主动结束生命的过程。凋亡又称程序性细胞死亡，是有核细胞在一定条件下通过启动自身内部机制，主要是内源性DNA内切酶的激活，而发生的死亡过程，是受基因调控的主动的细胞死亡方式，与坏死有着本质的不同。细胞坏死的形态学特点是膜通透性增加，内质网扩张，线粒体及核肿胀，发展为细胞膜破裂，溶酶体破坏，内容物外溢，同时引起严重的炎症反应。而细胞凋亡的特征是细胞变圆，胞浆浓缩，内质网泡状扩张，细胞碎裂成多个有包膜的凋亡小体，DNA断裂呈梯状结构。原位末端标记法(TUNEL)是将凋亡特异的末端酶打开DNA的
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