xhibited ischemic cell changes (red and ghost neurons), while apoptotic bodies were also apparent. In addition, TUNEL study demonstrated that no cells were positively labeled until 24 hours after ischemia, but nuclei of some motor neurons were positively labeled at peak after ischemia reperfusion at 72 hours. Conclusion Spinal cord ischemia in rabbits induces morphological and biochemical changes suggestive of apoptosis. These data raise the possibility that apoptosis contributes to neuronal cell death after spinal cord ischemia.
KEY WORDS: spinal cord ischemia reperfusion injury; delayed paraplegia; apoptosis
脊髓损伤是人类严重致残和死亡的重要原因。缺血性脊髓损伤是多种损伤疾患的后遗症，如胸腹主动脉瘤手术治疗可能发生因脊髓缺血所致的截瘫，其发病率高达30%[1];脊柱脊髓手术时常遇到难以解释的问题，如脊髓解剖血管丰富的部位T79，术中并未波及脊髓，术后有时却出现不明原因的脊髓损伤;腰椎管减压术后亦出现术后症状逐渐加重现象;颈腰椎间盘摘除术中并未损伤脊髓及供应脊髓的血管，但部分患者症状改善后会再次出现脊髓损伤症状，其机制尚不清楚。本研究旨在建立兔脊髓缺血再灌注损伤后延迟性瘫痪模型的基础上[2]，研究脊髓缺血再灌注损伤后延迟性瘫痪的病理和脊髓神经细胞死亡方式及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰白兔48只，体重(2.1±0.25)kg，雌雄不拘。随机均分为对照组(sham组，n=24)和脊髓缺血再灌注组(IR组，n=24)，两组又分为再灌注8h组(IR8组)、24h(IR24组)、72h(IR72组)和168h组(IR168组)，每组各6只。
1.2 动物模型的建立 白兔麻醉后，参照并改进Zivin等[3]方法，建立脊髓缺血再灌注延迟性瘫痪模型。具体方法如下：常规无菌消毒，取腹右肋缘下切口，切口长约2cm，暴露并分离腹主动脉，紧靠右肾动脉分支下方用两枚动脉夹夹闭腹主动脉，缺血26min后松开动脉夹，开放再灌注。缺血时间以夹闭瞬间开始计时，松夹瞬间计时再灌注时间。各组均在术前经耳缘静脉按150u/kg给予肝素。对照组仅暴露腹主动脉，不夹闭。切口分层缝合，每日腹腔内注射青霉素80万单位，连续3d。所有动物均在手术后60min内清醒。
1.3 神经功能的观察 各组分别于术后8、24、72、168h观察其后肢运动功能。兔致伤后参照Jacobs等[4]方法对各组兔后肢运动功能进行评级。具体标准如下：0级，全瘫(针刺无反应);1级：严重瘫痪，最小功能性运动(肌肉搐动);2级：能进行功能性运动(受累肢体可负重)，但不能齐足跳动，有共济失调和轻瘫(跛行);3级：能齐足跳动，但有共济失调和轻瘫;4级：齐足跳动，轻度共济失调和(或)轻瘫(奔跑但不够灵活);5级：正常。据此以0-3级为截瘫标准，计算出各组兔的截瘫率。
1.4 石蜡标本的制备 各组于缺血再灌注相应时间后麻醉，然后用生理盐水和多聚甲醛心脏灌注固定脊髓组织，切取L3-L5段脊髓组织，行石蜡包埋切片(4μm)。HE 染色： 切片常规用二甲苯脱蜡, 逐级乙醇漂洗, 苏木素染色, 盐酸乙醇分化、脱水, 中性树胶封片。
1.5 TUNEL原位末端标记 组织切片常规脱蜡后逐级乙醇至复水化，蒸馏水冲洗，胃蛋白酶消化60min，流水冲洗中止反应。组织切片用缓冲液漂洗后滴加标记液50μL，覆盖组织切片，PBS漂洗2次后置内源酶阻断剂，PBS漂洗2min，湿盒内用HRPavidin点片，PBS洗2次，DABH2O2显色10min，流水冲洗后常规脱水，树胶封片。试剂由武汉博士德公司提供，具体操作方法参照试剂盒说明书。
1.6 图像分析 以OLYMPUS BH2显微镜将图像传入电脑，随机选取10个视野，选取同一染色条件
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