型胶原用链霉蛋白酶(Pronase 1g/L)，Ⅹ型胶原用蛋白酶(Protease 0.02g/L)室温处理30min，加入一抗在4℃孵育过夜，用碱性磷酸酶生物素标记的第二抗体孵育30min。用3hydroxy2naphtylocid 2, 4dimethylanilid在室温下进行呈色反应。细胞核用苏木素复染，用水溶性封片剂封固观察。阳性表达为基质和细胞周围出现红染颗粒，应用图像分析系统进行灰度扫描并分析，灰度扫描切片细胞核不复染。
1.2.5 软骨终板血管芽相对面积测量 取HE染色切片，低倍光学显微镜下(×40)计数软骨终板血管芽数(头侧和尾侧血管数之和除2)。血管面积占终板区域相对数使用方格法(图1)。各组取10个标本，各个标本连续8μm横断面切片2张，显微镜下采集图像，尺寸定标，形成图形数据，医学图像分析软件自动分析。
1.2.6 软骨终板钙化层、非钙化层厚度测量 采用HE染色切片，以潮标为分界线，40倍显微镜下，测定每组椎间盘软骨终板正中矢状面的前侧1/3、中心点、后侧1/3钙化层和非钙化层的厚度，取3处测量的平均值，计算非钙化层/钙化层比值(图2)。
图1 血管面积相对数计算示意图(略)
Fig.1 The relative area of blood vessel (HE×100)
图2 软骨终板钙化层、非钙化层厚度测量(略)
Fig.2 The measurement of cartilage endplate (HE×100)
1.2.7 骨皮质厚度指数测量 取股骨中部横断面HE染色切片，光学显微镜下测量计算骨皮质厚度指数，计算方法如下：
骨皮质厚度指数=AB+CD/AD
其中AB、CD、AD如图3所示(4-8个部位处测量后求均值)。
1.2.8 骨小梁相对面积测量 胫骨中上的石蜡切片经HE染色后应用图像分析系统分析测量。以关节软骨1mm以下的松质骨区域，每张切片测量3个视野(×40，测定面积限定为274753μm2)，取平均值，测量平均骨小梁相对面积。
图3 骨皮质厚度指数测量示意图(略)
Fig.3 The index of bone cortical thickness
1.2.9 骨矿密度测定 用QDR2000型HOLOJAC双光子骨密度仪测量四肢骨与腰部椎体骨矿密度，放射源为镅241Am，误差≤3%。测量时，将各离体骨按一定顺序放入有机玻璃盒内，每次放入7个标本。使用Regional high resolution QDR 4500小动物分析软件。
1.2.10 生物力学测定 右股骨用微机控制电子万能试验机进行三点力学试验，观察最大应力和应变。当外力作用于骨时，骨以形变产生内部的阻抗来抗衡外力，即骨产生的应力，用最大负荷力表示，单位为g/cm2。应变是指骨在外力作用下的变形，用应力作用后至断裂的最大位移距离表示，单位为厘米。测量时，调整两个约束支架相距20mm，将大鼠股骨比较均匀的部位放在约束支架上，股骨的短轴与垂直方向平行，逐级加压直至破坏，读取导致破坏的负荷的数据。待测标本用生理盐水保持湿润，荷载测量精度为0.1N(牛顿)，变形测量精度为0.001mm。
1.3 统计学处理 所有数据输入计算机，用SPSS 10.0 for windows软件进行变量Pearsons相关分析，计算结果以均值±标准差(±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 组织学观察 老龄大鼠出现了骨质疏松的征象，如骨小梁稀疏，排列不整，骨小梁间隙增大，骨小梁面积比增大等;同时出现了椎间盘退变的征象，如软骨终板血管芽减少，纤维环排列不规则等。各个相关指标检测结果见表1。
2.2 骨质疏松和椎间盘退变的相关性分析 骨皮质厚度指数、骨小梁相对面积、股骨骨密度、椎体骨密度与终板血管芽相对面积、非钙化/钙化层比值、Ⅱ型胶原表达定量之间存在中度到强度的负相关，和Ⅹ型胶原表达定量之间，存在中度到强度的正相关，其中椎体骨密度与软骨终板的Ⅹ型胶原表达相关性最强(图4)。椎间盘退变的相关指标不仅与邻近椎体的骨密度相关，而且与遥远部位股骨的骨密度相关。但是，生物力学指标最大变形和最大负荷与椎间盘退变的各个指标无相关性。
表1 老龄大鼠骨质疏松和椎间盘退变相关指标的检测结果(略)
Table 1 The values of the indexes of
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