eks bone marrow BMP2 decreasing expression; D: after 2 weeks bone marrow PPARγ expression; E: after 4 weeks bone marrow PPARγ expression; F: after 8 weeks bone marrow PPARγ expression (×400)
3 讨论
自Pietrogrand和Mastomarine于1957年首先报道了短期大剂量使用糖皮质激素可致股骨头坏死以来[1]，国内外学者对激素性股骨头坏死进行了大量的研究，并相继提出了脂肪代谢紊乱学说、血管内凝血学说及骨质疏松学说等，但确切发病机理迄今仍未明了[23]。兔常被用于建立激素诱导性股骨头坏死模型，但糖皮质激素的用量、类型和股骨头坏死的发病率各家报道不一;同时，在建立股骨头坏死模型过程中，单独应用激素还是联合应用一些辅助制剂(如内毒素、马血清等)各家意见尚存分歧。现在虽然有人认为单纯应用激素不能诱导动物产生股骨头坏死这一理论过于武断[4]，但在临床实际中不会对正常人应用大剂量激素，或是长期小剂量应用激素，只是在肾病综合征、感染性休克、妊娠并发症、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病时应用激素较多，且较容易出现股骨头坏死的并发症。这就说明在大部分激素性股骨头坏死的临床病例中，在应用激素以前机体已经有血液系统和脉管系统的病变基础或者有免疫系统失调，那么在建立股骨头坏死动物模型应用激素前，加用一些辅助制剂造成血液系统和脉管系统病理改变后，再应用激素，这样更接近临床发病及治疗情况，由此建立的动物模型更有利于对临床治疗及预防的研究。事实上，在加用辅助制剂后建立模型的效率会大大提高，造模时间相对缩短[56]。
用马血清致动物出现Ⅲ型变态反应，抗原抗体复合物沉积在血管壁上引起超敏性血管炎，此后应用糖皮质激素可抑制胶原和弹性纤维的合成，进而导致小动脉断裂或栓塞，髓内出血，最终导致股骨头坏死。同时，激素诱导骨髓脂肪化，脂肪细胞增生肥大，成骨细胞减少;髓内压升高，血管受压，脂肪损害血管内皮局部血栓形成，或脂肪栓塞进一步导致骨坏死的发生[7]。Matsui等人[8]用马血清使兔出现过敏性血管炎，进而用激素诱导兔ANFH模型，组织切片观察发现4-6周后出现骨髓坏死，6-8周后出现骨坏死。Nakata等人[9]采用间隔3周2次注射马血清制作骨坏死模型，观察到红细胞外渗及小动脉微血栓是骨坏死的早期病理改变。这种病理改变与骨髓及肾小球内免疫复合物沉积关系密切。虽然，他们建立了典型的骨坏死模型，但都没有提及造模动物的死亡率。本研究用马血清10mL/kg(间隔3周)耳缘静脉注射两次，进行预实验时发现，动物死亡率极高(预实验6只兔子，死亡5只，均在2次马血清注射后5min内发生死亡)。故本研究对以往造模方式进行了改进：应用马血清10mL/kg，经兔耳缘静脉注射，间隔3周，按6mL/kg的剂量经兔耳缘静脉再次注射马血清;间隔2周后，腹腔注射甲基强的松龙，按45mg/kg连续3d，每天注射1次。在第2次静脉注射马血清时，降低马血清用量使动物的死亡率大大降低(1/20，1只兔子死亡而且发生在2次马血清注射后第2天)。本实验结果显示这种方法可以建立典型的股骨头坏死的动物模型，而且，动物死亡率大大降低。国内虽有类似的研究[10]，但本研究在马血清的用法上更为简单。
近年来，在激素性股骨头坏死发病机理的研究中，有人提出激素的应用诱导骨髓基质干细胞向脂系分化增强同时向骨系的分化减少[11]。这一细胞分化方向的改变在股骨头坏死的发病过程中起重要作用。本研究选择骨髓基质干细胞向上述两个方向分化时，两种重要的标志性蛋白PPARγ及BMP2进行免疫组化检测以进一步研究激素性股骨头坏死的发病机理。实验结果显示，造模动物于造模后2、4、8周PPARγ的表达逐渐增强，且与对照组比较表达明显增强(P<0.05)。相反，造模后2周，造模动物BMP2弱表达，以后时段无明显表达[12]。故这是否提示激素诱导骨髓基质干细胞使其高表达促成脂蛋白而降低表达促成骨蛋白，进而导致骨髓脂肪化、骨坏死发生，尚有待进一步研究。
【参考文献】
[1]Mont MA, Hungerford DS, Maryland B. Current concepts review: nontraumatic avascular necrosis of the femoral head [J]. J Bone Joint Surg, 1995, 77A(3):459473.
[2]Dresche
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