压注射器作髓核注射，缓慢自动推注。针定位依靠组织的抵抗力确定，在穿越组织时突感抵抗力消失有落空感后即停止，此时注射针已穿破纤维环进入髓核。对于练习者，髓核内的定位验证可通过推入液体有抵抗力而确认。实验前培训实验者，在新西兰大白兔标本反复操作，达完全熟练。
动物注射后，常规关闭伤口。术后，放入动物房，自由饮食。术后1、3、6月取材。实验中，8只兔子(在3个时间点分别为2、3、3只)用于组织学及免疫组化分析， 24只用于RTPCR分析蛋白多糖及Ⅰ、Ⅱ型胶原基质基因的表达。
1.3 组织形态学观察
所取椎间盘组织，经40g/L多聚甲醛固定，80g/L的中性EDTA脱钙液脱钙40d，常规石蜡包埋，用90g/L的多聚赖氨酸处理载玻片，切片，厚6-8μm，伊红苏木素染色。
1.4 蛋白多糖染色
软骨蛋白多糖用1g/L甲苯胺蓝染色。
1.5 Ⅰ、Ⅱ型胶原单克隆抗体免疫组化染色
椎间盘Ⅱ和Ⅰ型胶原用单克隆抗体免疫组织化学染色测定。椎间盘组织石蜡切片用二甲苯脱蜡、逐级乙醇水化后，用透明质酸酶(Hyaluronidase 2g/L)室温孵育30min。Ⅱ型胶原用链霉蛋白酶(Pronase 1g/L)，Ⅰ型胶原用蛋白酶(Protease 0.02g/L)室温处理30min，加入一抗在4℃孵育过夜, 用碱性磷酸酶生物素标记的第二抗体孵育30min。用3hydroxy2naphtylocid 2,4dimethylanilid在室温下进行呈色反应。细胞核用苏木素复染, 用水溶性封片剂封固观察。阳性染色为基质和细胞周围出现红染颗粒。
1.6 实时荧光定量RTPCR
髓核组织取材后放入液氮快速冷冻后，使用研钵研磨。RNA提取应用异硫氰酸盐酚氯仿法，用硅胶旋转柱纯化RNA，放入-80℃保存。通过光吸收法测量RNA的纯度，每个椎间盘大约4-5μg RNA。使用RTPCR试剂盒，细胞RNA逆转录为cDNA并通过PCR扩增特定的基因。Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖引物通过Primer 5.0软件设计，引物由上海基因公司合成。上游和下游引物序列及片断大小见表1。定量PCR采用DNA Master SYBR Green I反应系统，20μL PCR反应体系，在实时荧光定量PCR仪中反应。反应条件为：GADPH：95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延长12s。温度转化速率20℃/s，循环数35;其余视基因不同，参数有所变化。融化曲线通过20℃/s的转换速率将温度降至60℃后，0.1℃/s的速率将温度升至95℃，检测每一步的荧光强度。正常对照组1月的平均值认定为100%，其余值与对照组比较换算为相对值。表1 实时荧光定量PCR分析髓核基质基因及内对照的引物(略)
1.7 统计学分析
对于RTPCR分析所得值，采用重复测量方差分析进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
所有新西兰大白兔顺利完成手术并康复。取材后，肉眼观察未见各组椎间盘出现异常情况。
2.1 组织形态学的变化
椎间盘HE染色(图1)发现细胞移植组Ⅰ、Ⅱ髓核有较多的细胞。在1、3、6月时间点，各组纤维环排列尚规则，髓核无纤维化、裂隙，髓核内没有观察到血管化、炎症细胞浸润，无椎间盘退变的明显征象，但在细胞移植组Ⅰ、Ⅱ髓核内有较多的细胞。
2.2 蛋白多糖染色结果
蛋白多糖染色(图2)显示在椎间盘的髓核及部分纤维环出现兰染，在1、3、6月各个时间点，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ比正常对照组兰染增加，而生理盐水组和正常对照组相比无明显改变，细胞移植组Ⅱ与细胞移植组Ⅰ相比无明显改变。在细胞移植组，同组内3个时间点比较，6月点的兰染最深，3月次之。
2.3 免疫组化染色Ⅰ、Ⅱ型胶原表型表达的比较
Ⅰ型胶原单克隆免疫组化染色显示椎间盘的纤维环出现红染颗粒，并波及髓核外部，髓核内部未见红染颗粒。各组无明显差异。
Ⅱ型胶原单克隆免疫组化染色(图3)显示红染颗粒主要出现在椎间盘的髓核及内侧纤维环，以内侧纤维环红染最强。在各个时间点，细胞移植组Ⅰ、Ⅱ比正常对照组红染，而生理盐水组和正常对照组相比无明显改变。在细胞移植组，同组内3个时间点比较，6月点的红染最深，3月次之。
2.4 RTPCR分析基质基因的mRNA的改变
在3组间，RTPCR分析值显示了统计学的差异(P=0.006)，但时间和兔个体(区组
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