研究鲜见报道。本实验运用膜片钳技术观察mPSL对成骨细胞LVSCCsC的影响。
1 材料与方法
1.1 试验细胞
成骨细胞(MC3T3E1细胞株，购于协和细胞中心)传代培养。原代成骨细胞用0.125%的胰蛋白酶，37℃水浴消化5min，收集细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清，传于培养皿中，用含20%胎牛血清的IMDM培养，置于CO2孵箱。实验温度(22±2)℃。培养48h后备用，每株传2～4代。实验时用浴液完全置换培养基。
1.2 mPSL的配制和组别设计
mPSL(批号H20040338，Pharmacia NV/SA生产，40mg/瓶)，溶解后，取12.5μL原液，加入细胞浴液112.5μL，标记A液;取12.5μL原液，加细胞浴液1237.5μL，标记B液;取12.5μL原液加细胞浴液12487.5μL，标记C液。从备用液体A、B和C中分别取12.5μL，置于终末液体体积为1mL的培养皿中，mPSL的浓度为104mol/L、105mol/L和106mol/L。传代后的细胞分为4组，正常对照组、104mol/L组、105mol/L组和106mol/L组，每组记录10个成骨细胞钙离子电流。除正常组外，各组依次(每个皿)给予A、B和C液12.5μL，作用24h后进行膜片钳实验。
1.3 钙通道记录细胞浴液及电极液(单位均为mmol/L)[3]
细胞浴液：NmethylDglucamine(NMDG+) 110， BaCl2·2H2O20，HEPES10，glucose10，pH=7.4 (NMDG+缓冲)。电极液：NMDG+100，HEPES150， EGTA20，CaCl2·2H2O， MgCl2·6H2O，pH=7.4(KCl缓冲)。
1.4 全细胞记录模式纪录Ca2+离子电流
电极由硬质玻璃毛胚(内径1.6mm，壁厚0.2mm)经二次拉制而成，充以电极内液后阻抗1～4MΩ。用微电极操纵器将电极缓慢推向细胞，负压吸引形成高阻封接后吸破电极尖端上的细胞膜形成全细胞记录模式，然后补偿膜极电容和串联电阻。电压钳制脉冲和数据采集由Pclamp软件(美国Axon Instrument，6.02)控制，刺激信号经D/A转换器(1200 A/D、D/A，AXON.INC，美国)和膜片钳放大器(Axonpatch200B,美国)，在电极内形成钳制电压。电流信号经膜片钳放大器输入到模/数(A/D)转换卡，变成数字化信号输入计算机，其数字化频率为1kHz，低通滤波器滤波频率为1kHz。参考文献[2]的方法,记录ICa的保持电位为-70m V，阶跃命令为+10mV，脉宽400ms，从-50mV开始，阶跃至+60 m V。
在全细胞电流记录过程中，选用30～50μM的细胞，细胞破膜后的封接电阻大于100MΩ以上，记录观察电流10min，未见明显衰减，用于实验的记录。实验温度为(22±2)℃。
1.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差(±s)表示，均值比较采用单因素方差分析(SPSS 11.5软件包),检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MG3T3E1细胞钙电流的特性分析
在正常对照组，钙通道大约在-20mV时开放，最大峰值电流在+20～+30mV(0.2284±0.0209，nA)，反转电位在+60～+70mV( 图1a，图1b)。当在浴液中加入Co2+(50nmol/L)，可阻断此电流的大部分电流成分，其峰值电流为(0.1050±0.0097，nA)(图1b)。而Bayk 8644 增加了此电流(0.3335±0.0323,nA)(图1c)，表明在MG3T3E1细胞上存在对Co2+ 敏感的L型钙通道电流。这与文献报道相符[4]。
2.2 不同剂量sPSL对MG3T3E1细胞钙电流影响
应用同样的实验方法,在实验24h前加入mPSL 106mol/L 、105mol/L和104mol/L。记录MG3T3E1细胞上的钙电流，在+20mV时，其峰值电流分别为(0.1991±0.0158,nA)、(0.1839±0.0179,nA)和(0.1610±0.0033,nA)(图2)。经单因素方差分析F=19.9, P<0.01，结果见表1。表1 mPSL(106、105、104 mol/L)对钙离子通道电流的影响(略)注：与对照组相比,△P<0.01,与105mol/L m
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