西兰大白兔24只,雄雌不限,体质量(2.3±0.2)kg,由广东医学院实验动物中心提供。明胶(240270,加拿大BIO BASIC INC公司),京尼平(日本和光纯药工业株式会社),西门子X线机,Nikon数码显微镜。
1.2 明胶、京尼平颗粒骨复合物的制备
将切除的兔桡骨在冰生理盐水中用磨钻磨成颗粒骨,离心备用。在40 ℃无菌状态下,明胶与水混合并呈胶水状,加入4 g/L京尼平溶液,并与颗粒骨充分混合,形成明胶京尼平粘合颗粒骨的复合物,用管状物简单塑形后直接放置于骨缺损部位。
1.3 实验动物模型的建立与分组
兔前臂尺挠骨远近端为先天性愈合,单纯进行其中一骨的手术可不进行内外固定,而不会影响其稳定性,故选此动物模型。新西兰大耳白兔24只48条前臂,体质量(2.3±0.2)kg。按每公斤体质量1 mL的30 g/L戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉,前臂褪毛备皮,固定动物于手术台,消毒铺巾,取前臂外侧切口,长3.0 cm,推开趾长伸肌,即可暴露挠骨,距桡骨末端2 cm处为截点于近端1.5 cm处为第二截点,制成长1.5 cm桡骨骨缺损模型(图1a),同时剔除表面骨膜及对应尺骨骨膜以防出现骨膜成骨的影响,冲洗术野,并将切除的骨质用磨钻磨成颗粒骨。新西兰兔随机分为A、B、C、D共4组,每组6只:A组为空白组不填充任何材料;B组单纯填充20 mg明胶+60 μL水+20 μL 4g/L京尼平;C组单纯植入400 mg自体颗粒骨;D组填充20 mg明胶+60 μL水+20 μL 4g/L京尼平+200 mg自体颗粒骨混合后在体外塑形,植入缺损部位(图1b)。缝合伤口,无菌敷料包扎,单笼饲养自由活动,全价标准饲料饲养,自由饮水,每日补充50g新鲜青饲料,术后每只肌注庆大霉素4万U,每天1次,共3d。术后2、4、8周时各处死动物兔2只,取材进行以下观察。
1.3.1 大体观察 观察术后各组实验动物的活动、进食及伤口愈合情况,术后各取材时间点过量麻醉将动物处死,取桡骨观察形态、材料吸收及坚固融合等情况。在2周时,取出材料观察材料表面纤维包膜形成情况及颗粒骨是否松散,移位。
1.3.2 X线检查 于术后各时间点进行X线检测,比较各组骨缺损区修复情况。
1.3.3 组织学检查 分别于手术后4、8周各处死每组2只动物。在距离骨缺损端约10 mm截断桡骨,将其置于体积分数为10%福尔马林溶液中固定,常规脱钙,梯度酒精脱水石蜡包埋,纵行切片HE染色,在普通光学显微镜下观察骨缺损修复及颗粒骨与周围骨质融合情况。B、D组取缺损段周围软组织切片检查,观察有无炎症异物反应。
2 结果
2.1 大体观察
各组动物术后第3天起正常进食、活动,手术伤口周围软组织未见红肿坏死,无炎性分泌物。A、B组骨缺损模型无骨愈合迹象,在4、8周时断端髓腔闭塞,缺损段为纤维组织连接(图2a)。术后2周时C组材料表面有纤维组织包裹,但颗粒骨有明显的松散、移位情况,不规则骨痂形成;D组可见移植物有纤维组织包裹,外形维持较好,骨痂规整,说明明胶、京尼平起到了粘合颗粒骨使其在包膜形成前不松散的目的。C、D组4周时颗粒骨之间及其截骨端形成坚固的骨质融合,其中C组外骨痂形成较为分散。C、D组在8周时骨缺损端均有良好的愈合效果,C组骨皮质凹凸不平(图2b),D组塑形良好与正常桡骨无异(图2c)。
2.2 X线结果
A、B组各时间点均无骨愈合迹象,4周两骨断端有轻度硬化、增生,8周可见骨断端完全硬化,髓腔封闭,骨缺损略缩小(图3a)。C、D组2周时均可见颗粒骨变模糊说明颗粒骨之间及颗粒骨与周围骨质间有融合现象,C组模糊影较大,周围软组织处亦可见小许高密度影,表明植入颗粒骨较为松散、有游离;8周时,C、D组均有较满意的骨修复效果,髓腔相通,但D组塑形与正常桡骨形态相似(图3c),C组塑形效果较差,仍有小许骨痂影(图3b)。
3.3 组织学观察
A、B组在8周时截骨端髓腔闭合,周围为纤维组织包裹。C组2周时可见颗粒骨表面及内部有大量胞浆丰富、多核的破骨细胞和胞浆较丰富、层状排列的成骨细胞对其进行重建,颗粒骨之间有较多的新骨形成,颗粒骨之间发生融合(图4a)。D组2周时组织学形态与C组相似,但由于粘附剂的作用使颗粒骨间隙小,骨间融合程度高,显“网格”状(图4b)。4周时C组外周骨已无法辨认颗粒骨外形,颗粒骨融合并有大片新生骨形成(图5a);D组外周骨已大量形成了片状、与长轴平行的骨板(图5b)。8周时,D组镜下表现与正常骨形态相似,髓腔相通,有正常皮质、骨小梁形
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