骨碎补总黄酮对实验性兔膝骨性关节炎软骨及滑膜的影响

　　骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性退行性关节疾病，以关节软骨退变及继发性骨质增生和滑膜改变为主要特征。目前，我国已进入老龄化社会，OA的发生也日益增多。骨碎补总黄酮是水龙骨科植物干燥根茎中提取的黄酮类化合物，研究发现骨碎补总黄酮可以抑制巨噬细胞分泌细胞因子[1]。本研究通过观察骨碎补总黄酮对实验性兔膝骨关节炎软骨、滑膜组织形态变化的影响，同时采用免疫组化法对关节软骨及滑膜中金属蛋白酶-3(MMP-3)的表达进行检测，探讨骨碎补总黄酮治疗骨性关节炎的机制，为今后临床应用骨碎补总黄酮治疗骨性关节炎提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 6月龄新西兰大白兔32只，雌雄不限，平均体重(2.0±0.2) kg，由徐州医学院实验动物中心提供。室温下饲养，自由摄食、饮水。

　　1.2 主要试剂和设备 骨碎补总黄酮胶囊(北京歧黄制药公司，0.25 g/粒),维固力(爱尔兰罗达药厂，0.25g/粒)，光学显微镜(OLYMPUS)，自动包埋机及石蜡切片机(LEICA)， MMP-3免疫组化检测试剂盒(武汉博士德)。

　　1.3 动物OA模型制备 采用膝关节伸直位制动法制作兔膝骨关节炎动物模型，将实验动物的左膝用石膏固定于伸直位，6周后去除石膏。建模成功标准：造模侧膝关节间隙较健侧变窄，患膝关节主、被动活动受限;大体解剖可见关节滑膜充血，关节表面失去光泽、粗糙、溃疡形成;镜下滑膜细胞增生、滑膜下层纤维增生。此动物OA模型的病理学变化与人类OA相似。

　　1.4 动物分组及处理 32只新西兰大白兔随机分为正常对照组、模型对照组、骨碎补总黄酮组和维固力组，每组8只。模型动物去除石膏即日开始灌胃给药，每日1次，共计8周。骨碎补总黄酮与维固力2种药物制成溶液，每日用量根据Meeh-Rubner公式A=K×W2/3×10-4计算，按成人(60 kg)体表面积与家兔体表面积换算。正常对照组每日以生理盐水6 ml·kg-1灌胃;模型对照组每日以生理盐水6ml·kg-1灌胃;骨碎补总黄酮组每日按35 mg·kg-1剂量给予骨碎补总黄酮溶液(6 g·L-1)灌胃，相当于成人剂量0.75 g·d-1;维固力组每日按69 mg·kg-1剂量给予维固力溶液(12 g·L-1)灌胃，相当于成人剂量1.5 g·d-1。

　　灌胃给药8周后，耳缘静脉栓塞法处死动物。取膝关节股骨髁及部分滑车部位的软骨和滑膜制作光镜标本，常规苏木精-伊红染色，中性树胶封片，镜下组织学检查。MMP-3免疫组化检测试剂盒行MMP-3免疫组化检测。

　　1.5 评价标准 软骨、滑膜组织形态学评价参照Mankin等[2]的骨性关节炎病理学评分标准评分。MMP-3表达的形态计量研究参考Pelletier等[3]的方法，其表达量用细胞分数即阳性细胞数占细胞总数的百分比来表示，最大值为100%。

　　1.6 统计学处理 均数以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　据Mankin′s评分标准，镜下关节软骨及滑膜的退变程度模型对照组评分明显高于正常对照组(P<0.01)，骨碎补总黄酮及维固力组评分均低于模型对照组(P<0.01)，骨碎补总黄酮组与维固力组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

　　模型对照组MMP-3水平较正常对照组明显升高(P<0.01)，骨碎补总黄酮组、维固力组MMP-3水平较模型对照组降低(P<0.01)，骨碎补总黄酮组与维固力组的MMP-3水平组间差异无统计学意义。结果见表2。表1 各组关节软骨及滑膜Mankin′s评分结果与正常对照组比较：*P<0.01;与模型对照组比较：#P<0.01表2 各组关节软骨、滑膜中MMP-3的表达 与正常对照组比较：*P<0.01;与模型对照组比较：#P<0.01

　　3 讨 论

　　为科学地评价某种干预因素对某种疾病的作用效果，选择并制作正确的动物模型对实验研究非常重要。目前在国外，膝关节制动OA模型已被应用于实验研究之中。该模型最大的优点是无须手术造模，避免了因麻醉或手术给实验带来的各种混杂因素干扰，更接近自然过程，且操作过程大大简化，降低了实验成本。

　　MMP-3被认为是导致关节软骨

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