和 转染犬骨髓间充质干细胞的比较

　　1.1.3 透射电镜观察

　　收集第3代MSC，25 g/L冷戊二醛固定后，PBS洗涤，10 g/L 锇酸后固定，梯度丙酮脱水，常规包埋、超薄切片，20 g/L醋酸铀和枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察其超微结构。

　　1.1.4 MSC表面抗原的流式细胞仪检测

　　取培养的第3代MSC，弃去培养液，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，用含体积分数10% FBS的l-DMEM终止消化，吹打、离心收集细胞，用0.01 mol/L PBS漂洗2次。分别取1 × 106 /mL密度的细胞悬液 50 μL与抗CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC抗体10 μL在室温下避光孵育20 min。0.01 mol/L PBS洗涤2次后，将洗涤后的细胞离心后重悬于0.5 mL PBS中，应用流式细胞仪检测分析。

　　1.2 rAAV-EGFP转染犬MSC

　　1.2.1 rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP转染MSC

　　取第4代MSC， 2.5 g/L的胰酶消化后，应用含体积分数10%FBS的l-DMEM液终止消化，吹打后离心，将细胞以2 × 104个/孔接种于2块12孔培养板， 37 ℃孵育过夜，以无血清DMEM液漂洗细胞两次，按感染复数(MOI)值(病毒基因数，v.g./cell)为2 × 104、1 × 105、5 × 105将无血清DMEM培养基与rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP混合液约400 μL加入每孔细胞中，及时混匀。以不进行病毒转染的MSC (MOI = 0)作为对照组，每组设复孔6孔。在37 ℃，体积分数5 % CO2 条件下孵育2 h，弃去培养液，更换新鲜的完全培养基继续在体外进行培养，以后每2 d更换1次培养基。分别于3、7、21 d后在荧光显微镜下观察拍照计数绿色荧光细胞，计算转染效率。每孔通过观察3个高倍视野，采用双盲法计数每100个细胞中的阳性细胞数，取平均值即为其细胞转染率。

　　1.2.2 MTT法检测细胞毒性

　　取第4代MSC，细胞悬液浓度调至1.0 × 103 个/孔，接种于96孔板中，37 ℃孵育过夜，DMEM漂洗两次，按上述MOI值将无血清DMEM培养基与rAAV1-EGFP、rAAV2-EGFP混合液约30 μL加入每孔细胞中，以不进行病毒转染的MSC为对照组，每组设复孔6孔，共分7组。于37 ℃培养箱孵育3 d、7 d，弃培养液，每孔加入完全培养基200 μL，MTT液(5 mg/mL) 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃上清加入DMSO 200 μL，振荡溶解15 min，于酶标仪上测定490 nm处的光密度D(490 nm)值。

　　1.3 统计学处理

　　实验数据以x ± s表示，采用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，样本均数间比较使用析因设计及单因素方差分析，P < 0.05认为具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 MSC形态观察

　　48 h更换培养液时，可见散在分布的贴壁细胞，呈梭形，有胞浆突起，少部分呈多角形。第5天见原来的单个细胞或细胞集落形成多个细胞克隆，细胞呈成纤维细胞样，呈平行排列或漩涡状生长。 第10 ～ 12天细胞克隆扩大直至铺满培养瓶底面(图1)。传代培养后的细胞不再以集落方式生长，而呈均匀性分布生长，且生长迅速，约6 ～ 8 d即可铺满全层;第15代以后，形态变平坦、宽大，分裂相减少，细胞质疏松，可见空泡，细胞老化，增殖明显变慢。Giemsa染色示第3代犬MSC呈条索状，有长的突足，细胞核较大，核仁明显(图2A)。

　　2.2 MSC超微结构特点

　　透射电镜观察可见，第3代MSC胞体较小，细胞核/浆比例大，胞核呈圆形或椭圆形，核仁明显，胞浆少，染色质较疏松，胞浆中线粒体、内质网等细胞器少，表现出早期细胞的特点(图2B)。

　　2.3 MSC表面抗原检测

　　取第3代MSC进行流式细胞仪检测显示，CD29(95.63 %)、CD44(97.89 %)表达阳性，而CD34(0.41 %)表达阴性(图3)。

　　2.4 rAAV-EGFP对体外培养MSC的转染率

　　荧光显微镜观察示，转染3 d后，rAAV1-EGFP(MOI = 2 × 104)组未观察到MSC表达EGFP荧光;随着MOI的增加，rAAV1-EGFP(MOI = 1 × 105)组及rAAV1-EGFP(MOI = 5 × 105)组个别细胞表达EGFP，但表达EGF

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