膝关节骨关节炎患者与正常人群的血清差异表达蛋白

　　Key words： osteoarthritis; knee; proteomics

　　[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci)，2009，30(3)：308-312]骨关节炎(Osteoarthritis， OA)指由多种因素引起关节软骨纤维化、皲裂、溃疡、脱失而导致的关节疾病。病因尚不明确、其发生与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素等有关[1，2]。蛋白质组学技术作为一项强大的工具可望为研究OA的发病机制提供更详细的信息。因此，本研究应用蛋白质组技术寻找骨关节炎患者和正常人的血清差异蛋白，希望所发现的差异蛋白能为解析OA的致病机制有所帮助，并进而发现OA的生物标志物以及提供该疾病靶向治疗的位点。

　　1 材料与方法

　　1.1 病例资料

　　10名符合诊断标准[1-3]的膝关节OA患者(1名男性和9名女性，平均年龄60.6(S = 7.4)，BMI 25.8(S = 4.4))和10名正常志愿者[1名男性和9名女性，平均年龄55.3(S = 4.5)岁，BMI 25.5(S = 3.5)]分别组成病例组与对照组，两组性别相匹配，年龄、BMI相当以减少混杂因素。本实验符合相关卫生部门的伦理委员会的原则。严格执行赫尔辛基宣言的相关规定，征得知情同意。

　　1.2 实验方法

　　对所有研究对象收集静脉血，在每个样本上加入蛋白酶抑制剂，然后分离血清样本保存在 -80 ℃备用。将30 ?滋L血清样本放入1 mL的离心管里面，根据ProteoPrep Blue Albumin & IgG Depletion Kit (SIGMA)试剂盒和2-D clean up kit (Amersham Biosciences)试剂盒的说明分别用于清除样本中的白蛋白与球蛋白和盐与脂。然后利用牛血清作为标准运用Bradford法测定浓度。按照G?觟rg等[4]方法和Bio-Rad仪器操作手册进行双相电泳。第一相等电聚焦(IEF)，血清的上样量总体积为0.35 mL，(含总蛋白质0.3 mg)。50 V 重泡胀12 h后进行等电聚焦，依次经过150 V 1 h、500 V 3 h、 1 000 V 1 h、 5 000 V 1 h、 7 000 V 2 h、10 000 V至总电压积为50 000 Vh。等电聚焦结束后，迅速取出IPG胶条，分别置于平衡液A(6 mmol/L Urea， 2% SDS， 50 mmol/L Tris-HCL pH 8.8， 30%甘油， 2% DTT)、平衡液B(6 mmol/L Urea， 2% SDS， 50 mmol/L Tris-HCL pH 8.8， 30%甘油，2.5%碘乙酰胺)中各平衡15 min。将平衡好的胶条转入proteanⅡxi cell垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，电泳条件为：每胶3 W电泳30 min，然后每胶7 W恒功率，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳，对凝胶进行银染。凝胶通过Image Scanner Ⅱ透射扫描仪及Labscan扫描软件进行扫描获取图像，软件找出差异点后沿边缘切取凝胶上的差异蛋白质点(表达量差异在3倍以上)，置于1.5 mL EP管内。50%乙腈和50 mmol/L碳酸氢铵脱色20 min，乙腈脱水，冷冻抽干。加入5 ～ 10 ?滋L TPCK处理的胰蛋白酶(12.5 ng/?滋L)，4 ℃冰箱中约30 min，取出后在37 ℃烘箱中酶解过夜。加入50%乙腈和0.1% TFA 混合液60 ?滋L，轻微振荡萃取30 ～ 40 min后，将溶液转移到新的96孔板内，重复3次。将肽段溶液在N2流下吹干浓缩，然后将完全干燥的肽段重新溶解于0.7 ?滋L CHCA溶液 (0.5 g/L，由0.1% TFA和50% CAN配制)中， 并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上并分析。MALDI-TOF-MS分析采用反射模式，正离子谱测定，激光源为355 nm波长的Nd：YAG激光器，加速电压为20 kV。仪器先用myoglobin酶解肽段进行外标校正。基质和样品的 PMF质量扫描范围为700 ～ 3 500 u。然后直接选择与对照基质的PMF

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