00 V 2 h、10 000 V至总电压积为50 000 Vh。等电聚焦结束后，迅速取出IPG胶条，分别置于平衡液A(6 mmol/L Urea， 20 g/L SDS， 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8，体积百分数为30%甘油，20 g/L DTT)、平衡液B(6 mmol/L Urea， 20 g/L SDS， 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8， 30%甘油， 25 g/L碘乙酰胺)中各平衡15 min。将平衡好的胶条转入proteanⅡxi cell垂直电泳槽中进行第二向电泳，聚丙烯酰胺凝胶浓度为120 g/L，电泳条件为：每胶3 W电泳30 min， 然后每胶7 W恒功率，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底部停止电泳。随后对凝胶进行银染。
1.5 凝胶图像分析
凝胶通过Image Scanner Ⅱ透射扫描仪及Labscan扫描软件进行扫描获取图像，利用ImageMaster 2D Elite 5.0分析软件对图像进行强度效正、点检测、背景消减、匹配。所有数据的统计分析在SPSS15.0软件上进行。
1.6 MALDI-TOF-TOF-MS质谱分析
沿边缘切取凝胶上的差异蛋白质点(表达量差异在3倍以上)，置于1.5 mL EP管内。50%乙腈和50 mmol/L碳酸氢铵脱色20 min，乙腈脱水，冷冻抽干。加入5 ～ 10 μL TPCK处理的胰蛋白酶(12.5 ng/μL)，4 ℃冰箱中约30 min，取出后在37 ℃ 烘箱中酶解过夜。加入体积百分数为50%乙腈和1 g/L TFA 混合液60 μL，轻微振荡萃取30 ～ 40 min后，将溶液转移到新的96孔板内，重复3次。将肽段溶液在N2流下吹干浓缩，然后将完全干燥的肽段重新溶解于0.7 μL CHCA溶液(0.5 g/L，由1 g/L TFA和体积百分数为50% CAN配制)中， 并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上并分析。 MALDI-TOF-MS分析采用反射模式，正离子谱测定，激光源为355 nm波长的Nd：YAG激光器，加速电压为20 kV。仪器先用myoglobin酶解肽段进行外标校正。基质和样品的 PMF质量扫描范围为700 ～ 3 500 u。然后直接选择与对照基质的PMF图有差异的肽段离子进行MS/MS分析。所有实验样品的质谱图均用默认模式获得。
1.7 数据库检索
利用软件Mascot distiller过滤基线峰、识别信号峰。利用Matrixscience公司的Mascot软件搜索NCBInr数据库(http：//www.matrixscience.com)，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能， 来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。查询条件：物种来源选择human，肽质量控制在800 ～ 4 000 u;PI值范围：4 ～ 7;肽片段分子量最大容许误差控制在 ± 0.5 u;离子选择MH+和monoisotopic;最小匹配肽片段数规定为4;固定修饰为半胱氨酸碘乙酰胺化(Carbamidomethyl)，可变修饰为蛋氨酸氧化(Oxsidation)。
1.8 酶联免疫吸附试验
另外10例腰椎间盘突出患者和10例正常人利用酶联免疫吸附试验测定所得出蛋白的血清学水平，实验方法依照试剂说明使用。
2 结 果
10 名患者和10名正常对照的血清样本经过双向电泳分析及银染后得到蛋白电泳图谱。在实验组与对照组中蛋白点数量分别为950 ± 50和920 ± 50。大部分点均集中在10到120 ku及PI 4 ～ 7。各双向电泳图蛋白分布样式相似，匹配性好。在所用的腰椎间盘突出病例组出线的上调或下调大于3倍的蛋白点均予以苯甲基磺酰氟化物处理，通过质谱分析及蛋白数据库检索确认蛋白。若蛋白点具有较高的分数及较高次序的覆盖，那结果的可靠性就更高。最后，我们鉴定出6个蛋白，所有6个蛋白在患者与正常组双向电泳凝胶上均为显著地连贯地表达(图1)。这些点经过消化及分析，结果如表1所示。
载脂蛋白L1在椎间盘患者血清表达而正常组不表达，载脂蛋白M、四连接素及免疫球蛋白轻链在腰椎间盘突出患者血清比正常人血清分别降低(22 ± 3)%(P﹤0.01)，(37 ± 5)%(P﹤0.01)， (27 ± 3)%(P﹤0.01)。
在另外一组患者与正常人中前面所说的4种蛋白的平均浓度通过酶联免疫吸附试验得到确认，载脂蛋白M、四连接素及免疫球蛋白轻链在腰椎间盘突出症患者血清浓度比正常人均降低(P﹤0.05)，相反，载脂蛋白L1在腰椎间盘突出症患者血
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