增
选取髂前上棘为取材点。穿刺区常规消毒铺巾，局部麻醉成功后用16 G骨髓穿刺针平行刺于髂骨内外板之间，抽取10 mL骨髓，穿刺前骨穿针及注射器管常规用肝素抗凝处理。
MSCs的体外培养采用全骨髓法。将所取骨髓加入无血清DMEN培养基洗涤，离心后去除上清液及脂肪层，加入含15%FCS的DMEN培养基，分别接种于3个25 mL的玻璃培养瓶中，于37 ℃、5%CO2 、饱和湿度培养箱中培养。24 h后换液，去除大部分未贴壁的细胞，此后每3～4 天换液一次，细胞呈漩涡样排列生长，70 %融合时1∶3传代。选择P0或P1代细胞作为移植细胞。0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入无血清DMEN培养基反复吹打洗涤细胞，离心去上清，取底层浓缩的MSCs，加生理盐水至4 mL备用。镜下观细胞为梭形，呈漩涡样生长。经流式细胞仪FCM检测，(85.23±10.11)%细胞CD34，CD45阴性，CD29，CD44阳性，符合hMSCs特征。FCM计数细胞浓度为24 000个/mL,总数96 000个(见图1～2)。
1.3 经皮移植自体MSCs
在“C”型臂X线机透视监视下准确定位。骨穿针或12号注射器针头准确刺入骨不连部位的间隙，缓慢注入经体外培养、扩增了的自体MSCs。针头轻微前后摇摆后缓慢拔出。间隔1月重复注射1次,5月后未见骨折愈合趋势者停止该治疗。
2 结果
12例患者均获得了随访，随访时间12～30月，平均18月。骨折愈合标准为患者临床症状消失，影像学检查示骨折线消失、有骨痂生长。其中9例获得了骨性愈合，骨折平均愈合时间为5月(4～7月)，骨折愈合率为75%(912);3例未愈合者均为骨折端间隙过大，骨质缺损较多,表现为肢体负荷时骨折处疼痛，X线显示骨折线清晰可见，无骨痂生长，后采用切开植骨内固定治疗。无骨折畸形愈合及明显影响肢体功能者(见图3～5)。 图3 胫骨骨折术后12月显示骨不连; 图4 自体MSCs移植后5月显示骨折愈合; 图5 钢板取出术后显示骨折骨性愈合
3 讨论
四肢骨干骨折多由于暴力创伤致骨折后骨折端血供破坏而发生骨不连。目前对于四肢骨折骨不连的处理多为外科手术，通过切开内固定加植骨(或带血管蒂骨瓣移植)治疗，疗效满意，可以尽早恢复肢体的功能从而提高生活质量，因此是治疗的金标准。但是外科手术创伤大，并发症较多，尤其是供骨区疼痛及影响外观，且手术治疗较复杂，花费较多增加了患者的经济负担。随着分子生物学技术及组织工程的研究进展，特别是随着MSCs成骨化的深入研究，骨不连的治疗观点发生了较大的变化，采用自体MSCs移植治疗骨不连成为目前闭合治疗骨不连的一种新方法。
骨折愈合在细胞水平包括以下4个连续的过程：细胞募集、骨诱导、调控及骨传导。骨折发生后，临近及全身的成骨性干细胞募集于骨折处，骨折局部的骨形态发生蛋白(BMP)等骨生长因子分泌增多，诱导干细胞向成骨细胞分化，出现骨再生，进而依据Wolff定律进行骨改造与塑形。因此，如果骨折愈合过程中的某一个或多个阶段受到阻碍，如成骨性干细胞的数量过少，都必然造成骨不连。
MSCs是来源于中胚层的多能干细胞，它可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞等分化，具有很强的成骨分化能力[3]。骨折部位移植自体MSCs的目的在于利用其具有向成骨细胞分化成骨的潜力达到促进骨折的愈合。在一些细胞因子如BMP、TGFβ等诱导下可以向成骨细胞分化。本课题的实验研究部分证实腺病毒介导的BMP2基因转移可以促进人间充质干细胞成骨化。动物试验发现骨髓中的干细胞浓度与骨髓成骨能力正相关。国内有学者报道抽取骨髓后分离浓缩间充质干细胞经皮注射治疗四肢骨折骨不连取得了成功[4]。说明在骨折的愈合过程中MSCs起着重要的作用。
临床研究也证实移植的干细胞浓度、总量与骨不连处骨痂量呈正相关，与愈合时间呈负相关[5]。原因可能是骨髓中MSCs的浓度很低，约为600个/mL,远远不能满足骨折愈合的需要。因此有学者提出，为提高胫骨萎缩性骨不连的治愈率，移植的干细胞浓度应大于1 000个/mL,总数应大于30 000个[6]。本组病例均采用自体MSCs体外培养、指数级扩增后注入骨不连处，MSCs浓度为24 000个/mL,总数96 000个，干细胞浓度与总量远远大于上述的数值，保证了骨折愈合细胞水平第一阶段即细胞募集阶段的质与量，达到促进骨折愈合的目的。
间充质干细胞的分化存在环境依赖性和骨诱导的问题，即在骨诱导因子如BMP等的诱导下定向向成骨细胞分化，但外源性基因转染(移)自体干细胞方法因涉及相关法规及伦理
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