的总RNA，从琼脂糖电泳分析清晰可见28s/18s/5s条带，其中28s∶18s条带的浓度比≈2∶1。表明所提的RNA无降解，用紫外分光光度计分析，其D260nm/D280nm>1.8，无DNA 污染，相对较纯，可以用于逆转录。
2.2 KiSS1、p27Kip1基因片段的克隆 用KiSS1或p27Kip1上下游引物分别经PCR扩增获得KiSS1基因和p27Kip1基因ORF片段，经琼脂糖电泳分析，其片段大小分别约400 bp和600 bp，与预期的KiSS1基因和p27Kip1基因ORF片段的438 bp和597 bp大小相符(图1)。
2.3 重组质粒pIRESKiSS1的构建和鉴定 将从胎盘组织中克隆的KiSS1基因的ORF片段连接到pIRES载体上，构建成pIRESKiSS1，经限制性内切酶XhoI和MIuI双酶切分析，产生438 bp的目的片段和6.1 kb的载体两个片段(图2)，经DNA测序分析，证实目的基因KiSS1插入后，其开放阅读框无改变。并将全序列与Gene Bank上已知序列进行BLAST分析，与从非转移性黑色素瘤细胞株中克隆的KiSS1基因的ORF序列同源性达100%。 1:Marker;2:目的基因.
2.4 重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1的构建和鉴定 将从胎盘组织中克隆的p27Kip1基因的ORF片段连接到已经酶切和DNA测序分行确证的载体pIRESKiSS1上，构建成重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1。分别应用限制性内切酶SalI与NotI和MIuI与XhoI双酶切后，可见438 bp的 KiSS1和597 bp的p27Kip1目的片段(图3)，提示目的基因片段已成功插入载体。经DNA测序分析证实目的基因p27Kip1插入方向正确，将全序列与Gene Bank上已知序列进行BLAST分析，与人p27Kip1基因的ORF序列同源性达100%。
2.5 pIRESKiSS1p27Kip1在骨肉瘤MG63细胞中的表达和表达产物的鉴定 重组载体pIRESKiSS1p27Kip1和空载体pIRES分别转染骨肉瘤MG63细胞，转染后48 h，在G418筛选培养基中生长的细胞出现生长抑制，细胞开始死亡，细胞数量减少，G418筛选2周后转染pIRESKiSS1p27kip1载体、pIRES空载体的细胞出现阳性克隆，3周后细胞呈集落生长，6周后细胞长满。
用Trizol法分别抽提转染pIRESKiSS1p27kip1载体、pIRES空载体的细胞和MG63细胞的总RNA，用RTPCR分别检测三株细胞的KiSS1和p27kip1mRNA的表达水平，三株细胞中仅在pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞中检测出KiSS1基因的转录产物(图4)，而MG63细胞、pIRESMG63细胞中未检测出KiSS1基因转录产物，各组细胞均存在p27kip1基因转录产物(图5)。
用Western blot分析pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞、pIRES MG63细胞和MG63细胞KiSS1和p27kip1蛋白质表达水平，仅在pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞组中存在KiSS1蛋白质的表达(图6)，而MG63细胞、pIRES MG63细胞组中无KiSS1蛋白质的表达。各组细胞均存在p27kip1蛋白质的表达，其中pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞组p27蛋白表达明显升高。
3 讨 论
目前，通过脂质体进行及基因转染，药物筛选得 1:Marker;2:pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞;3:pIRESMG63细胞;4:MG63细胞.到稳定转染细胞株的方法仍然是体外研究基因功能的常用方法。为进一步明确所构建的载体是否能在细胞内表达，笔者通过脂质体将所构建的载体转染到骨肉瘤MG63细胞中，经过最佳G418浓度筛选，获得了pIRESKiSS1p27kip1 MG63、pIRES MG63和MG63三种细胞。在通过RTPCR和Western blot对检测目的基因是否表达检测后发现，由于KiSS1基因在骨肉瘤MG63中表达缺失，故仅在pIRESKiSS1p27kip1 MG63细胞组中检测到KiSS1基因在mRNA和蛋白质水平上均表达。虽然p27基因在骨肉瘤MG63中存在mRNA和蛋白质的表达，但其蛋白表达量较转染共表达载体的细胞明显降低。这表明转染共表达载体细胞即pIRESKiSS1p27ki
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