系：总体积50 μL，由引物KiSS1R、KiSS1F各1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPMixture4 μL，高保真pfu酶1.25 μL，模板DNA 1 μL ，ddH2O 37.5 μL PCR扩增双链cDNA反应条件：KiSS1为94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。p27为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→59 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压110 V，电流强度20 mA)，检测PCR产物，对产物进行纯化。
1.2.3 pIRESKiSS1载体的构建 对KiSS1纯化产物和pIRES质粒进行双酶切(XhoI和MIuI)，酶切产物回收。用T4DNA连接酶将片段KiSS1和载体酶切片段。转化大肠杆菌感受态DH5α，并通过带有氨苄霉素(100 μg/mL)的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌收集菌液，采用TIAGEN质粒少量抽提试剂盒抽提质粒，用XhoI和MIuI进行双酶切，酶切产物于1%琼脂糖凝胶电泳分离，将酶切阳性者克隆，用该质粒的通用引物pIRESF测序，测序成功后获得重组质粒pIRESKiSS1。
1.2.4 pIRESKiSS1p27Kip1的构建 将pIRESKiSS1和经PCR扩增、胶回收纯化后获得的p27Kip1分别用上游SalI和下游NotI双酶切后，纯化连接转化，酶切鉴定，并通过该质粒的通用引物pIRESR测序鉴定后，命名重组质粒为pIRESKiSS1p27Kip1。
1.2.5 转染骨肉瘤MG63细胞 培养MG63细胞80%融合时进行转染，取重组质粒pIRESKiSS1p27kip11 μg以无血清的DMEM稀释至250 μL。取Lipofectamine2000 10 μL溶于250 μL DMEM中，室温孵育5 min，将上述液体混匀室温孵育20 min，加入MG63细胞中，放置37 ℃、6 h后小心吸去上清，更换为含10% FBS、DMEMH继续培养30 h。
1.2.6 筛选骨肉瘤MG63细胞 通过脂质体将重组质粒pIRESKiSS1p27Kip1转染到骨肉瘤MG63细胞内，培养36 h后更换含10%FBS培养液，并加入G418使其浓度达500 μg/mL，继续培养3～4 d，待细胞大部分死亡后，调整G418浓度至300 ng/mL，继续培养，约持续培养4周左右单克隆形成后挑取一单克隆传入96孔板中待其长满后传入6孔板中继续扩增。筛选得到的细胞为pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞和转染空载体的pIRES MG63细胞。
1.2.7 RTPCR检测MG63细胞、pIRES MG63细胞、pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞KiSS1和p27kip1mRNA的表达 Trizol法抽提总RNA，建立逆转录合成单链cDNA反应体系，获得各组细胞cDNA。PCR反应：反应体系cDNA 2 μL，dNTP 5 μL，上下游引物混合物2 μL，buffer 5 μL，TagDNA Polymerase 0.5 μL，定容至25 μL。反应条件：KiSS1和p27kip1同前。
以βactin为内参照，序列
F：5’ATTCCTATGTGGGCGACGAG3’
R：5’AGAGGCGTACAGGGATAGCA3’
反应条件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s→58 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min。反应结束后1.2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。
1.2.8 Western blot法检测转染后MG63细胞、pIRES MG63细胞、pIRESKiSS1p27kip1MG63细胞KiSS1和p27kip1基因的表达 收集培养板内细胞，于15%分离胶、5%浓缩胶行SDSPAGE电泳，湿式转膜(120 mV，120 min)，PVDF膜(0.22 μm)经脱脂奶粉封闭4 ℃过夜，分别用兔抗人KiSS1/ p27kip1一抗(1∶200)，室温孵育2 h，TBST洗10 min×3次，辣根过氧化物酶标记鼠抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育1 h，TBST洗10 min×3次，依ECL发光试剂盒说明书曝光、显影。
2 结 果
2.1 抽提总RNA 通过Trizol法抽提胎盘组织
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