【摘要】目的 克隆肿瘤转移抑制基因KiSS1和细胞周期依赖性激酶抑制剂基因p27Kip1的表达序列，应用内部核糖体插入位点(IRES) 序列构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，测序鉴定，并获得稳定表达目的蛋白的细胞株。 方法 利用RTPCR从人正常胎盘组织中获得KiSS1和p27Kip1基因开放阅读框的cDNA序列，将两目的基因的cDNA序列重组至pIRES载体，构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，应用脂质体转染骨肉瘤MG63细胞，并通过RTPCR和Western blot检测目的蛋白的表达情况。 结果 经PCR、酶切鉴定和基因序列测定，证实重组入pIRES载体上的两个片段均为目的基因开放阅读框的核苷酸序列，KiSS1和p27Kip1蛋白在转染后的细胞中有表达。 结论 成功构建共表达载体pIRESKiSS1p27Kip1，获得稳定表达KiSS1和p27Kip1蛋白的细胞株，为进一步观察目的基因对骨肉瘤细胞体内外效应奠定基础。
【关键词】 p27Kip1蛋白 骨肉瘤 肿瘤抑制 KiSS1基因 细胞周期蛋白质类 肿瘤细胞
KiSS1基因是一种肿瘤转移抑制基因，通过和MMP9基因相互作用来增加细胞间的黏附并抑制肿瘤细胞的转移[12]。p27Kip1蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)的负性调控因子，文献报道在骨肉瘤等多种恶性肿瘤中，其表达降低并与多种肿瘤恶性程度相关[3]。为研究此两种基因在抑制骨肉瘤增殖和转移中是否存在协同作用，笔者克隆KiSS1和p27基因，通过真核表达载体pIRES，构建能分别表达KiSS1和p27Kip1 蛋白的共表达载体，应用脂质体转染骨肉瘤细胞，经G418筛选获得能稳定表达目的基因的骨肉瘤MG63细胞，观察目的基因对骨肉瘤细胞的体内外效应。
1 材料与方法
1. 1 材料
1.1.1 试剂 真核表达载体pIRES(美国Clontech公司)。大肠杆菌DH5α为本室保存。逆转录试剂盒、限制性内切酶、T4DNA ligase(美国Fermentas公司)。高保真PfuDNA聚合酶(美国BioFlux公司)，细胞总RNA抽提试剂Trizol Reagent、脂质体Lipofectamine2000(美国Invitrogene公司)，DNA纯化试剂盒及胶回收试剂、质粒小抽试剂盒(北京天根生化)。兔抗人KiSS1、兔抗人p27、兔抗人βTubulin一抗(美国Santa Cruz公司)，HRP标记的鼠抗兔二抗(美国Pierce公司)。
1.1.2 主要仪器 Gene Amp PCR System(9700型，美国Perkin Elmer 公司)，Gel Doc凝胶成像仪(2000型，美国BioRad公司)，DU800紫外分光光度仪(美国Beckman 公司)。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 分别根据Genebank报道人KiSS1基因(登录号AY117143)和p27Kip1(登录号AF247551)基因的ORF设计引物。为了将目的基因克隆至真核载体pIRES和提高酶切效率上，在上游引物和下游引物5′端加上含有限制性内切酶和相应保护碱基的接头。序列(由上海鼎新生物公司合成)：
KiSS1基因
上游：5’CCGCTCGAGATGAACTCACTGGTTTCTTG3’
下游：5’CGACGCGTCACTGCCCCGCACCTG3’
p27Kip1基因
上游：5’ACGCGTCGACATGTCAAACGTGCGAGTGTC3’
下游：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTACGTTTGAC
GTCTTCTG3’
1.2.2 KiSS1、p27Kip1基因的获得 RTPCR从胎盘组织中克隆两个目的基因，术中取材，选取胎盘组织约0.3 g，采用Trizol法抽提总RNA。建立逆转录合成单链cDNA：反应体系：RNA 2 μg，Oligo(dT) 1 μL DEPC处理水10 μL，70 ℃水浴5 min后迅速入冰降温，加入5×Buffer 4 μL，4×dNTP 2 μL，RNasein 1 μL，37 ℃水浴5 min，冰浴，离心。加入MMLV逆转录酶1 μL(总体积20 μL)，混匀离心，42 ℃水浴60 min。70 ℃水浴10 min终止反应。PCR反应体
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